MERPs im Gehirn der Hausmaus : Untersuchung ihrer möglichen Bedeutung für die Verhaltensplastizität durch in-situ Hybridisierung, reverse Transkriptase-Polymerase Kettenreaktion sowie immunhistochemische Methoden - Hinchliffe, David; Justus Liebig University Giessen (My University, 2013)
In der vorliegenden Arbeit wurden Untersuchungen an dem Ependymin-verwandten Protein MERP in der Hausmaus nach einem Lernparadigma vorgenommen. Im Folgenden werden die gewonnenen Erkenntnisse und die daraus resultierenden Schlussfolgerungen kurz zusammengefasst. 1. Die verwendeten Mäuse des Inzucht Stamms C57BL/6J haben sich bewährt, um das hier angewendete Lernparadigma durchzuführen. Dabei handelte es sich um einen Lernversuch zur räumlichen Orientierung, das Morris Water Maze. Anhand der Auswertungen konnten die eingesetzten Mäuse eindeutig in die Gruppen der Lerner und der nicht-Lerner eingeordnet werden. Somit war die Voraussetzung zur Durchführung der nachfolgenden Versuche gegeben. 2. Sowohl durch die in-situ Hybridisierung, als auch durch die reverse Transkriptase-PCR sind Zeitverlaufskurven für die mRNA Synthese des MERP2 im Anschluss an ein Lernereignis erstellt worden. Beide Kurven ähneln sich trotz unterschiedlicher Untersuchungsmethoden. Der erhaltene Verlauf zeigte einen ersten Anstieg, welcher vermutlich im Zusammenhang mit dem durch die Trainingssituation induzierten Stress steht. Nach einem Absinken der Kurve schließt sich eine weitere Steigung an, deren Maximum jedoch nicht detektiert wurde. Dieser zweigipflige Verlauf ähnelt dem der Ependymin-mRNA, welcher nach einer Konditionierung im Goldfisch erhalten wurde. Von mehreren anderen Arbeitsgruppen wurden ähnliche Zeitverläufe für weitere Proteine beschrieben. Eine Verlaufskurve für das MERP1 konnte nur durch die RT-PCR aufgenommen werden. Das geringe Vorkommen der MERP1-mRNA und seine wenig veränderten Konzentrationen lassen auf eine Duplikation des evolutionär älteren Gens, des MERP2, schließen, mit resultierendem Funktionsverlust (oder zumindest starker Expressions-Verminderung bei der Duplikation). 3. Die Lokalisierung der mRNA des MERP2 ergab eine weitere Übereinstimmung zum Goldfisch Ependymin. Der Syntheseort liegt anscheinend im Bereich der Meninx, wobei eine Präferenz der dorsalen, rechten Hemisphäre diskutiert wurde. Die Fibroblasten stellen dabei hervorragende Kandidaten als synthetisierende Zellen dar.4. Die immunhistochemischen Untersuchungen des Proteins ergaben mehrere Ergebnisse. Zum einen wurden Signale im Bereich der Meninx entdeckt, homolog zur Lage der MERP2 mRNA. Des Weiteren sind Antikörpermarkierungen an endomeningealen Invaginationen und an auskleidenden Zellen des dorsalen dritten Ventrikels detektiert worden. Beides ist übereinstimmend mit den Erkenntnissen aus den Ependymin-Untersuchungen am Goldfisch. Ebenso wurde das MERP an Neuronen des Hippocampus, vor allem der CA3-Region und des Gyrus dentatus, registriert. Diese spielen eine wichtige Rolle bei der räumlichen Orientierung und der Langzeitgedächtnisbildung. Anhand von konfokalen Aufnahmen konnte die Vermutung bestätigt werden, dass sich die Immunreaktivität an hippocampalen Neuronen in zirkulär-verlaufenden Schlingen anordnet. Dies könnte ein Hinweis auf eine Faser-Bildung sein und somit im Einklang zur Arbeitshypothese über die Funktionsweise des Ependymins beim Goldfisch stehen.Aus diesen Ergebnissen ergeben sich folgende Schlussfolgerungen: 1. Auf Grund der vielen Übereinstimmungen des MERP2 mit seinem verwandten Protein, dem Ependymin, in allen untersuchten Bereichen ist auch eine ähnliche Funktion innerhalb des Mausgehirns durchaus möglich und sogar wahrscheinlich. Somit wäre eine Rolle bei der Stabilisierung von neuronalen Verbindungen ebenso denkbar, wie eine Beteiligung an der Richtungsführung des axonalen Wachstums. 2. Im Gegensatz zum Ependymin handelt es sich beim MERP2 nicht um das prädominante Protein der extrazellulären Gehirnflüssigkeit. Vielmehr scheint es ein weiterer Bestandteil des Orchesters an Molekülen der extrazellulären Matrix zu sein und dort im Zusammenspiel mit anderen Molekülen eine Rolle bei der Plastizität des Gehirns und der allgemeinen Stabilität der neuronalen Verbindungen zu übernehmen.

Tests were performed to analyse the Mammalian Ependymin Related Protein (MERP) in Mus musculus after a learning paradigm. The findings and conclusions are outlined below.1. Inbred C57BL/6J mice are approved in performing the implemented learning paradigm, a spacial learning task named after its inventor Richard Morris, the Morris Water Maze. By analysing their performances the mice were classified as learners or non-learners . Hence, the requirements were given to carry out the intended experiments. 2. Time-dependent progressions of the MERP2-mRNA synthesis after a learning event have been received using in-situ hybridisation as well as reverse transcriptase-PCR. Though two different methods of analysis have been used, both progressions resemble each other. A first increase in the mRNA concentration is presumably related to stress generated during the learning paradigm. After declining, a second increase of the measured data was seen, but the maximum was not detected. This bimodal progression has similarities to the one received for Ependymin after conditioning of goldfish. Furthermore, different groups reported similar time-dependent progressions for other proteins after learning-events. MERP1 could only be detected by using RT-PCR. Its low abundance and marginal change in its concentration leads to the assumption that the MERP1 may be a duplication of the evolutionary older gen, the MERP2. This could have resulted in a loss of function, or at least a strong decline in its expression level. 3. Localisation of the MERP2-mRNA revealed a further analogy with the goldfish Ependymin. Apparently, the place of synthesis is within the area of the meninx. A preference for the right dorsal hemisphere has been discussed. Fibroblasts represent excellent candidates to be these synthesising cells. 4. Immunohistochemical analysis produced several results: On the one hand, signals could be detected in the area of the meninx, similar to the localisation of the MERP2-mRNA. Furthermore, antibody-staining was seen at cells of endomeningeal invaginations and cells coating the dorsal third ventricle. Both results are homologous with the findings for Ependymin in goldfish. MERPs were also were detected at structures of the hippocampus, in particular at the CA3-region and the dentate gyrus. These tissues are known to play an important role in spacial orientation and in long term memory formation. Using confocal fluorescence microscopy, immunoreactivity distributed in form of circular structures at hippocampal neurons. This might be an indication of fibre formation and is therefore consistent with the working hypothesis for the action of Ependymin during memory consolidation in goldfish. The results implicate two conclusions:1. Based on the analogies of MERP2 with its related protein, the Ependymin, in every field analysed, a similar function within the mouse brain appears to be possible and even likely. Therefore, participation during consolidation of new neuronal connectivities as well as a role in axonal guiding is intriguing. 2. In contrast with the Ependymin, MERP2 is not the predominant protein of the extracellular brain fluid. It rather is another component of the orchestra of molecules in the extracellular matrix and joins in during plasticity of the brain and the consolidation of neuronal connectivity.
Keywords: Plastizität; Langzeitgedächtnis; MERPs; Hausmaus; ddc:570