Molekulargenetische Charakterisierung von Schafrassen Europas und des Nahen Ostens auf der Basis von Mikrosatelliten - Peter, Christina; Justus Liebig University Giessen (My University, 2005)
Ziel dieser Arbeit war es, eine Evaluierung der verwendeten Mikrosatelliten vorzunehmen, auf ihrer Basis die genetische Vielfalt zwischen und innerhalb von Schafrassen Europas und des Nahen Ostens zu charakterisieren und Populationsstrukturen aufzuzeigen. Hierfür wurden 57 autochthone und internationale Schafrassen an 31 Mikrosatellitenloci (BM1329, BM1824, BM8125, DYMS1, HUJ616, ILSTS005, ILSTS011, ILSTS28, INRA63, MAF33, MAF65, MAF70, MAF209, MAF214, MCM140, MCM527, OarAE129, OarCP34, OarCP38, OarFCB20, OarFCB128, OarFCB193, OarFCB226, OarFCB304, OarHH47, OarJMP29, OarJMP58, OarVH72, SR-CRSP-1, SR-CRSP-5 und SR-CRSP-9) untersucht, wobei insgesamt 1748 Tiere aus 15 Ländern in die Untersuchung eingingen. Je Rasse wurden zwischen 17 und 31 unverwandte Tiere analysiert. Basierend auf den Allelfrequenzen wurden nach Überprüfung des Hardy-Weinberg-Gleichgewichts und des Kopplungsgleichgewichts genetische Diversitätsparameter (mittlere Anzahl Allele je Rasse und erwartete Heterozygotie unter Annahme des Hardy-Weinberg-Gleichgewichts) berechnet und die genetische Differenzierung der Rassen mit Hilfe der F-Statistik erfasst. Des Weiteren wurde in allen Rassen das Vorliegen eines Flaschenhalses überprüft und eine Rassezuordnung ( Breed Assignment ) durchgeführt. Weiterhin erfolgte auf Basis der genetischen Distanz nach Reynolds (DR) die Erstellung eines Neighbor-Net und eines phylogenetischen Neighbor-Joining Konsensus-Baums. Schließlich wurden eine Hauptkomponentenanalyse und eine Bayesian Model-based Clustering Analyse durchgeführt und der Genfluss zwischen den Rassen bestimmt. Unter adaptiver Selektion stehende Mikrosatelliten wurden mit Hilfe einer so genannten Ausreißer-Analyse identifiziert. Die 21 Marker BM1329, BM1824, BM8125, ILSTS005, ILSTS011, ILSTS28, INRA63, MAF33, MAF65, MAF70, MAF209, MAF214, MCM140, OarFCB20, OarFCB128, OarFCB226, OarJMP29, OarJMP58, OarVH72, SR-CRSP-1 und SR-CRSP-9 können uneingeschränkt für die Verwendung im Rahmen von Diversitätsstudien beim Schaf empfohlen werden, was für sieben weitere in dieser Untersuchung verwendeten Mikrosatellitenmarker nicht der Fall ist. Dazu gehören zum einen die beiden Marker HUJ616 und OarCP38, welche trotz Modifikation der PCR-Bedingungen in ihrer Typisierungseigenschaft sehr unzuverlässig waren. Bei den drei Markern OarAE129, SR-CRSP-5 und MCM527 gibt es Hinweise auf das Vorliegen von allelen. Für die Mikrosatellitenmarker OarFCB193, OarFCB304 und HUJ616 konnte im Rahmen der Ausreißer-Analyse ein unter adaptiver Selektion stehendes Verhalten nachgewiesen werden, was eine Kopplung mit verschiedenen Kandidatengenen vermuten lässt. Für die drei Marker BM1329, DYMS1 und OarHH47 wurden in vorhergehenden Studien Kopplungen mit Kandidatengenen nachgewiesen. Im Rahmen dieser Untersuchung konnte aber keine Selektion an diesen Genorten aufgezeigt werden. Daher erscheinen diese Marker zwar für Diversitätsstudien beim Schaf geeignet, es kann aber davon ausgegangen werden, dass sie nicht neutral sind. Es wurden insgesamt 564 Allele an den 31 untersuchten Mikrosatellitenloci identifiziert. Alle untersuchten Marker erwiesen sich als polymorph, wobei die Anzahl der Allele zwischen sechs (SR-CRSP-5) und 41 (MAF241) lag. Die mittlere Anzahl Allele betrug 18,2. Die erwartete Heterozygotie unter Annahme des Hardy-Weinberg-Gleichgewichts reichte von 0,63 (Exmoor Horn) bis 0,77 (Ruda) und betrug im Mittel 0,72. Die mittlere Anzahl Allele je Rasse reichte von 5,74 in der Grauen gehörnten Heidschnucke bis 9,26 im Rumänischen Tsigai. Unter Annahme des Hardy-Weinberg-Gleichgewichts (HWG) konnte für nahezu alle Rassen ein Heterozygotendefizit nachgewiesen werden, welches sowohl auf Inzucht als auch auf Substrukturen innerhalb der Populationen zurückzuführen ist. Weiterhin konnte ein Südost-Nordwest-Diversitätsgefälle aufgezeigt werden. Dies verdeutlicht die Bedeutung des Erhalts der südosteuropäischen Schafrassen, da diese ein 'Reservoir' genetischer Diversität darstellen. Gleichzeitig wiesen verschiedene Analysen (Neighbor-Net, Hauptkomponentenanalyse, Bayesian Model-based Clustering Analyse) auf eine Trennung der nordwest- und westeuropäischen Rassen auf der einen Seite und der südosteuropäischen Rassen (einschließlich der des Nahen Ostens) auf der anderen Seite hin, was durch den Einfluss einer europäischen und einer asiatischen mtDNA-Linie bzw. die unterschiedlichen Ausbreitungswege der Landwirtschaft im Neolithikum erklärt wurde. Zwischen einer Reihe von Rassen vor allem Südosteuropas (Bardhoka, Ruda, Shkodrane, Karagouniko, Orino, Rumänisches Tsigai, Turcana, Karayaka und Dagliç) konnten nur geringe genetische Distanzen nachgewiesen werden, die durch hohen Genfluss verursacht werden. Dies konnte auf den türkischen Einfluss während des Osmanischen Reiches zurückgeführt werden. Des Weiteren zeigten einige Rassen (z.B. Skopelos) deutliche Hinweise auf Gründereffekte. Die Bayesian Model-based Clustering Analyse ermöglichte es trotz Abweichungen vom HWG verdeckte Populationsstrukturen aufzuspüren, Ähnlichkeiten zwischen Rassen darzustellen und Einflüsse anderer Rassen nachzuvollziehen. So konnte unter Annahme von zwei Subpopulation eine geographische Trennung der Rassen dargestellt werden, während bei Erhöhung der Anzahl von Subpopulationen auf drei bis fünf eine Trennung der Rassen anhand des Phänotyps erfolgte. Da die Analyse unabhängig von jeglichen Annahmen über Mutationsmechanismen ist, stellt sie ein wichtiges Instrument zur Beurteilung der Einzigartigkeit verschiedener Rassen dar und kann somit einen bedeutenden Beitrag für Entscheidungen im Rahmen von Erhaltungsmaßnahmen leisten. Ein durchschnittlicher FST(W& C)-Wert von 0,057 demonstrierte eine mäßige, aber höchst signifikante genetische Differenzierung der Schafrassen, so dass es im Rahmen der Rassezuordnung ('Breed Assignment') deutliche Unterschiede in der Zuverlässigkeit der Zuordnung gab. In den stark differenzierten Rassen Graue gehörnte Heidschnucke und Rhönschaf, polnisches Wrzosowka und den britischen Rassen Scottish Blackface, Swaledale, Exmoor Horn wurden alle Individuen ihrer richtigen Ursprungsrasse zugeordnet. Weniger differenzierte Rassen Südosteuropas wurden nur unzureichend zugeordnet. Dies deutet darauf hin, dass 31 Mikrosatellitenmarker zwar bei genetisch stark differenzierten Rassen für eine korrekte Rassezuordnung ausreichen, nicht aber, um genetisch gering differenzierte Rassen wie die Südosteuropas zu unterscheiden. Weiterhin wurde gezeigt, dass phänotypische und genetische Diversität sehr häufig nicht übereinstimmen. So ähneln sich die beiden zu den Heideschafen zählenden Rassen Graue gehörnte Heidschnucke und polnisches Wrzosowka phänotypisch sehr stark. Anhand der genetischen Analysen zeigte sich aber eine klare Differenzierung. Im Gegensatz dazu ähneln sich Rassen wie die griechischen Sfakia und Anogeiano sowohl phänotypisch als auch genotypisch. Auf der anderen Seite unterscheiden sich die türkischen Rassen Morkaraman und Akkaraman zwar phänotypisch, es konnte aber gezeigt werden, dass sie sich genotypisch sehr stark ähneln. Dies beweist die Notwendigkeit der Einbeziehung genetischer Information in die Etablierung von Erhaltungsprogrammen, sei es, wie in dieser Arbeit erfolgt, auf Basis von Mikrosatelliten oder ergänzend auf Basis von SNPs, mitochondrialer DNA und Y-chromosomaler Information.

The aim of the study was to evaluate the microsatellite markers for future diversity studies, to characterise the genetic diversity within and among European and Near Eastern sheep breeds and to assess population structures. Therefore 57 autochthonous and cosmopolitan sheep breeds were genotyped for 31 microsatellite markers (BM1329, BM1824, BM8125, DYMS1, HUJ616, ILSTS005, ILSTS011, ILSTS28, INRA63, MAF33, MAF65, MAF70, MAF209, MAF214, MCM140, MCM527, OarAE129, OarCP34, OarCP38, OarFCB20, OarFCB128, OarFCB193, OarFCB226, OarFCB304, OarHH47, OarJMP29, OarJMP58, OarVH72, SR-CRSP-1, SR-CRSP-5 and SR-CRSP-9). A total of 1748 sheep samples from 15 countries were analysed. Sample sizes ranged from 17 to 31 unrelated animals per breed. Based on allele frequencies the whole dataset was checked for deviations from Hardy-Weinberg equilibrium and for linkage disequilibrium. To measure within population diversity, the mean number of alleles per breed as well as the expected heterozygosity assuming Hardy-Weinberg equilibrium was estimated. F-statistics was applied to characterise genetic differentiation. Based on Reynolds genetic distance a neighbor-net and a neighbour-joining consensus-tree were constructed. In addition all breeds were checked for recently experienced bottlenecks and breeds assigned to their population of origin. For further analyses of population structure a principal component and a Bayesian model-based clustering analysis were performed. In addition gene flow between breeds was determined. In order to detect signs of adaptation, an outlier analysis was carried out. Twenty-one markers (BM1329, BM1824, BM8125, ILSTS005, ILSTS011, ILSTS28, INRA63, MAF33, MAF65, MAF70, MAF209, MAF214, MCM140, OarFCB20, OarFCB128, OarFCB226, OarJMP29, OarJMP58, OarVH72, SR-CRSP-1 and SR-CRSP-9) can be recommended for diversity studies in sheep without any restrictions, while seven markers cannot. First, microsatellites HUJ616 and OarCP38 behaved very unreliable within PCR-amplification despite of modification of PCR-conditions. Markers OarAE129, SR-CRSP-5 and MCM527 are suspected to have alleles, while the outlier analysis revealed signatures of adaptive selection for markers OarFCB193, OarFCB304 and HUJ616, pointing at possible linkage to several candidate genes. In former studies linkage with different candidate genes has been demonstrated for markers BM1329, DYMS1 and OarHH47. However, within this study no signs of selection were detected. Therefore these markers are suitable for diversity studies in sheep, but it has to be kept in mind that they cannot be considered neutral. A total of 564 alleles were detected at the 31 microsatellite loci analysed. All microsatellite markers were polymorphic with the number of alleles ranging from six (SR-CRSP-5) to 41 (MAF241). The average number of alleles per marker was 18.2. The within-breed unbiased expected heterozygosity assuming Hardy-Weinberg equilibrium varied between 0.63 in the British Exmoor Horn and 0.77 in Romanian Ruda. Across all breeds expected heterozygosity averaged 0.72. The mean number of alleles per breeds varied from 5.74 in German Grey Heath to 9.26 in Romanian Tsigai. Assuming Hardy-Weinberg equilibrium, a heterozygote deficiency was observed for almost all breeds, which was due to inbreeding and substructures within populations. Furthermore a Southeastern-Northwestern diversity decline was demonstrated, showing that in particular Southeastern European breeds form a reservoir of genetic diversity in sheep. In addition several analyses (neighbor-net, principal component analysis and Bayesian model-based clustering analysis) revealed a clear distinction of Northwestern and Western European breeds on the one hand and Southeastern European breeds (including Near Eastern breeds) on the other hand. This pattern was explained by the influence of a European and an Asian mtDNA-lineage or the spread of agriculture during Neolithic times. Several breeds from Southeastern Europe (Albania, Romania, Greece, and Turkey) showed low genetic distances caused by a high gene flow, which was explained by the Turkish influence during the Ottoman Empire. Furthermore some sheep breeds revealed a founder effect, e. g. Greek Skopelos. Despite deviations from Hardy-Weinberg equilibrium Bayesian model-based clustering analysis identified hidden population structures, revealed genetic similarities among breeds and influence of different breeds on each other. Assuming two subpopulations revealed a geographical pattern while assuming three to five subpopulations showed a distinction based on phenotype. The advantage of this analysis is its independence of particular mutation models and it therefore presents a suitable tool to evaluate the uniqueness of a breed. Hence it contributes to decision making within conservation programmes. A mean FST(W&C)-value of 0.057 indicated a moderate, but highly significant genetic differentiation among breeds. Therefore breed assignment tests achieved very diverse results. In clearly differentiated breeds like German Grey Heath and Rhoensheep, Polish Wrzosowka and British Scottish Blackface, Swaledale and Exmoor Horn all individuals were assigned to the right breed. Less differentiated breeds of Southeastern Europe were very poorly assigned. This implicates that 31 microsatellite markers are sufficient for clearly differentiated breeds but unsuitable to assign individuals that are less differentiated like Southeastern European sheep breeds. In addition it was demonstrated that phenotypic and genotypic diversity very often do not coincide. While, for example, the German Grey Heath as well as the Polish Wrzosowka belong to the same group of sheep (heath sheep) and are phenotypically very much alike, genetic analyses showed clear differentiation. In contrast the two Greek sheep breeds Sfakia and Anogeiano resemble each other phenotypically as well as genotypically. On the other hand the Turkish breeds Akkaraman and Morkaraman differ in phenotype but genetic analysis revealed clear similarity. These results point at the importance of including genetic information in terms of microsatellites, SNPs, mitochondrial DNA or Y-chromosomal information in the decision making of conservation programmes.
Keywords: ddc:630