Tgfbr3 regulates alveolarisation in late lung development - Pozarska, Agnieszka Ewa; Justus Liebig University Giessen (My University, 2020)
The Transforming growth factor (Tgf)-beta signalling pathway is a key regulator of lung homeostasis as it is involved in organ development, as well as in pathological conditions of stunted lung growth such as bronchopulmonary dysplasia (BPD). The accessory Tgf-beta receptor 3 (Tgfbr3), also known as betaglycan, is a key ancillary molecule in the Tgf-beta pathway that has been documented to be essential for the development of the mouse embryo. The siRNA-mediated knockdown of Tgfbr3 resulted in an increase in the proliferation and migration of primary mouse lung fibroblasts, independently of Tgf-beta ligand stimulation. To study the role of Tgfbr3 in post-natal lung development, a mouse strain carrying a floxed Tgfbr3 allele was created. The Tgfbr3 floxed mouse strain was crossed to mice expressing Cre recombinase specific to cells with smooth muscle properties, such as smooth muscle myosin heavy chain (SMMHC)+ cells, and platelet-derived growth factor receptor (PDGFR)alpha+ cells. Temporal conditional knockout of Tgfbr3 was induced in mouse pups at post-natal day (P)1 and P2, by administration of tamoxifen. Stereological analysis of lung structure at P7 revealed significantly decreased alveolarisation of the lung in both knockout mouse lines. It was demonstrated that genetic changes following in vivo knockout of Tgfbr3 from fibroblasts with smooth muscle cell properties include a pronounced increase in the expression of fibronectin, proliferating cell nuclear antigen and beta-catenin protein. A Tgfbr3-specific knockout in Tie2+ cells led to impaired lung development, with a decreased septal thickness and decreased vessel wall thickness. The potential downstream signalling mechanisms were investigated by whole-transcriptome microarray analysis following in vitro knockdown of Tgfbr3. Limb bud and heart (Lbh) was selected as a candidate gene that was demonstrated to have a significant impact on the migration and proliferation of primary mouse lung fibroblasts. This led to the study of the lung phenotype of the global Lbh knockout (KO) mice, which exhibited an increase in septal thickness. Data taken together data suggest novel role for Tgfbr3 in lung development and underscore it as a central regulator of late lung development.

Der Transforming growth factor (Tgf)-beta-Signalweg ist, sowohl in verschiedenen Entwicklungsprozessen, als auch in Krankheitsverläufen bei denen vermindertes Wachstum auftritt, wie zum Beispiel bei der Bronchonpulmonale Dysplasie, entscheident involviert. Somit stellt dieser Signalweg einen Schlüsselregulator in der Organmorphogenese und homöostase dar. Der Tgf-beta Rezeptor III (Tgfbr3), auch Betaglykan genannt, ist ein entscheidender Bestandteil des Tgf-beta-Signalwegs und auch für diesen Rezeptor konnte eine essentielle Rolle in der embryonalen Entwicklung der Maus und der Homöostase des vaskulären Systems nachgewiesen werden. Ein Knockout des Tgfbr3 mittels siRNA in Mausexperimenten, resultierte, unabhängig einer Stimulation des Tgf-beta-Liganden, in einer Erhöhung der Proliferation und Migration von primären Fibroblasten der Lunge.Zur Untersuchung der Rolle von Tgfbr3 in der postnatalen Lungenentwicklung wurden Tgfbr3 gefloxte Mäuse kreiert und mit zwei Cre Rekombinase exprimierenden Mauslinien gekreuzt. Diese Cre Rekombinase wird in den Mauslinien entweder in Zellen exprimiert, die schwere Myosinketten der glatten Muskelzellen (smooth muscle myosin heavy chain; SMMHC) positiv oder Thrombozyten-Wachstumsfaktor-Rezeptor alpha (platelet derived-growth factor receptor alpha; PDGFRalpha) positiv sind.Ein temporaler konditioneller Knockout von Tgfbr3 wurde mit Hilfe zweier Injektionen von Tamoxifen zum postnatalen Tag (P) 1 und P2 herbeigeführt. Stereologische Untersuchungen zum Zeitpunkt P7 zeigten eine signifikante Verringerung der Alveolarisierung in der Lunge beider Knockout-Mauslinien. Zudem konnte deutlich gemacht werden, dass genetische Veränderungen, durch in vivo hervorgerufene Knockdowns von Tgfbr3, bei primären Lungenfibroblasten zu einer signifikanten Erhöhung der Proteinexpression von Fibronektin, Proliferating-Cell-Nuclear-Antigen (PCNA) und beta-Catenin führte. Ein Tgfbr3 spezifischer Knockout in Tie2+-Zellen zeigten eine ähnliche Lungenentwicklung mit einer verminderten Septumsdicke und einer verminderte Gefäßwanddicke. Mit Hilfe von whole transcriptome microarray Analysen wurden die Auswirkungen auf potentielle Herunterregulierungen von Signalwegen und mechanismen untersucht. Im Rahmen dieser Analysen wurde das limb bud and heart (Lbh-Gen) näher betrachtet und es konnte ein Zusammenhang und signifikanter Einfluss auf die Migration und Proliferation von primären Lungenfibroblasten in der Maus aufgezeigt werden. Aufgrund dieses Zusammenhangs zwischen Lbh und primären Fibroblasten der Lunge wurden zusätzliche Versuche mit Lbh-Knockout-Mäusen durchgeführt. Dabei wurde bei stereologischen Auswertungen der Lunge eine Erhöhung der Septumsdicke deutlich.Die in dieser Arbeit aufgeführten Ergebnisse geben Hinweise auf eine neue Rolle von Tgfbr3 bei der Lungenentwicklung über die bereits bekannte Funktion als zentraler Signalwegsregulator hinaus.
Keywords: lung; development; alveolarization; tgfbr3; bronchopulmonary dysplasia; ddc:610