Einfluss der microRNA-322 bzw. microRNA-497 auf den in der Lungenentwicklung bedeutenden Signalweg von retinoic acid bzw. transforming growth factor-beta - Junker, Lena Alysha; Justus Liebig University Giessen (My University, 2019)
Die bronchopulmonale Dysplasie (BPD) ist eine Erkrankung, die bei Frühgeborenen durch lange Atemunterstützung entstehen und teils chronische Schäden zur Folge haben kann. Verbesserte Beatmungsstrategien haben zur Veränderung der Pathophysiologie, jedoch nicht zum Verschwinden der BPD geführt. Die markantesten Veränderungen sind die unausgereiften Gefäßstrukturen und die verringerte Oberfläche der Lunge durch unvollständige Septierung der Alveolensäckchen. Um den Kindern in der Zukunft eine noch bessere Versorgung zu gewährleisten, sollte zunächst versucht werden die Genese der BPD immer detaillierter zu verstehen und anschließend präventiv intervenieren zu können oder zumindest Therapieoptionen aufzufinden.Die in dieser Arbeit erläuterten Untersuchungen haben sich mit zwei, in der BPD bereits zuvor als beteiligt beschriebenen, Signalwegen befasst. Neu war zum Einen die Frage inwieweit Veränderungen in der Dynamik von microRNAs, genauer der microRNA-322 bzw. der microRNA-497, Einfluss auf den Signalweg von für Erstere retinoic acid, sowie für microRNA-497 von transforming growth factor-ß haben. Zum Anderen, welche pathophysiologisch denkbaren, relevanten Entwicklungen diese Mechanismen auf Zellebene schlussendlich hervorrufen. Die jeweilige Genexpression, nach Transfektion und Kultivierung der verschiedenen Zellen, wurde durch quantitative real time-PCR, die entsprechenden Proteinlevel mittels western blotting beurteilt.Obwohl als Zielgen der microRNA-322 prognostiziert, konnte in vitro die retinoic acid receptor-ß mRNA nicht als Ziel der microRNA-322 validiert werden. Als Kritik am generellen Versuchsaufbau ist zu sagen, dass es vermutlich Zellreihen gibt, welche besser die Eigenschaften von Lungenfibroblasten widerspiegeln, als die verwendeten NIH-Zellen. Weiterhin konnte in ex vivo Lungengewebe des BPD-Modells, keine verminderte Expression von RAR-ß entdeckt werden. Folglich ist RAR-ß vielleicht kein reales Ziel der microRNA-322.Beim Zielgen Smurf2, dessen Produkt als Inhibitor des TGF-ß-Signalweges wirkt, konnten die Vorhersagen der microRNA-497-induzierten Repression untermauert werden, zumindest sowohl in der Zellreihe A549, als auch in Primärzellen. Im TGF-ß-Signalweg wurden schon früher mehrfach sogenannte Feedbackmechanismen vermutet, welche zur Feinregulierung der Aktivierung beitragen. Dies war auch in der vorliegenden Studie eine Überlegung, um die nun verwirrenderweise resultierende Mehrexpression von Smurf2 nach Hyperoxieexposition von Lungenhomogenaten im Mausmodell der BPD zu begründen. Unterstützt wurde die Überlegung durch den in western blots begründeten Anhalt, für ebenfalls gesteigerte Rezeptoraktivierung und nachfolgend ausgelöste Phosphorylierung von Überträgerproteinen des Signalweges. Zur Darstellung der, nach mutmaßlicher Enthemmung des TGF-ß-Signals, auftretenden Konsequenzen auf Zellebene, wurden Markerproteine der Epithelial-Mesenchymalen Transition betrachtet. Dieser Vorgang kann mit Hilfe von TGF-ß eingeleitet werden. Die signifikant sinkende Anzahl des epithelialen Oberflächenmarkers E-Cadherin bzw. die Anreicherung typisch mesenchymaler Proteine, sowohl in der verwendeten Zellreihe A549, als auch in Primärzellen und in vivo-Lungen des BPD-Modells, lässt ähnliche Vorgänge annehmen. Zukünftig könnte die Idee der EMT in diesem Modell bestärkt werden, wenn z.B. die Migrationsfähigkeit der Zellen untersucht würde, welche diese durch modifizierte Proteinexpression erlangen müssten.

Bronchopulmonary dysplasia (BPD) is a disease in premature babies after a longterm respiratory support and it can cause chronic complications. Improvements in ventilation changed the pathophysiology, but could not erase BPD completely. The most striking changes are the immature vascular system and the reduced surface of the lung, because of incomplete secondary septation in alveolar saccules. To further improve treatments for those children in future, we have to know firstly about the genesis of BPD in more detail and then find ways of prevention, or at least therapeutic options.The examinations in this study considered two signaling pathways already known in BPD. What is new, is how the change of dynamics of microRNAs, particularly of microRNA-322 and microRNA-497, interfere with the signaling pathways, regarding the first microRNA of retinoic acid and in connection with microRNA-497 of transforming growth factor-ß. Moreover what kind of relevant developments these mechanisms finally evoke in the cell. After transfection and cultivation of the different cells, gene expres-sions were assessed with real time-PCR and corresponding protein levels through western blotting.Although predicted as a target of microRNA-322, the retinoic acid receptor-ß mRNA could not be validated as a microRNA-322 target in vitro. As general critique of the experimental setup could be said, that there might be cell lines which better reflect the properties of lung fibroblasts than the applied NIH-cells. Furthermore, in ex vivo lung tissue, decreased expression of RAR-ß was not detected in experimental BPD. Therefore, RAR-ß may not be a true target of microRNA-322.Regarding target gene Smurf2, its product functions as an inhibitor in TGF-ß signaling pathway, the microRNA-497-induced repression was confirmed, at least in cell line A549 and in primary cells. Feedback mechanisms were already assumed more often in TGF-ß signaling to contribute in regulating the activation. This was also an idea in the present study to explain the confusingly appearing overexpression of Smurf2, resulting in hyperoxia-exposed lung homogenates in the mouse model of BPD. The idea was supported by indications of yet increased receptor activation and following phosphorylation of downstream proteins shown in western blots. To display consequences of presumed deinhibition of TGF-ß signaling concerning the cells, epithelial-mesenchymal transition markers were regarded. This process can be initiated by TGF-ß. The significantly decreased number of epithelial surface protein E-cadherin and increase in typically mesenchymal proteins, in A549 cell line, as well as in primary cells and in vivo lung homogenates of BPD-model, suggests a similar process. In the future the concept of EMT in this model could be encouraged, if for example there would be studies about the ability of cell migration, which they should obtain through modified protein expression.
Keywords: ddc:610