Entwicklung eines humanisierten Mausmodells für X-chromosomale Retinitis Pigmentosa, hervorgerufen durch eine Punktmutation im Rpgr Gen - Schlegel, Jutta; Justus Liebig University Giessen (My University, 2011)
Mutationen im Gen des Retinitis Pigmentosa GTPase Regulators (RPGR)stellen die häufigste Ursache für X-chromosomale Retinitis Pigmenotsa (RP)dar. Die meisten der verantwortlichen Mutationen treten in einer spezifischenrepetitiven Region des terminalen Exons ORF15 auf, die deshalbals mutation hot spot bezeichnet wird. Punktmutationen im ORF15 verursachenLeserasterverschiebungen, die zu einer veränderten C-terminalenAminosäure-Kette mit möglichen toxischen Effekten führen. In dieser Arbeitwurde ein Mausmodell entwickelt, bei dem die Deletion eines Basenpaareszu einer Aminosäureveränderung führt, die der des menschlichenmutierten Proteins gleicht.Die pathologische Mutation und weitere stille Mutationen wurden mittelshomologer Rekombination eines Vektorkonstrukts in murine ES Zellen eingeführt.Die Genotypisierung der ES Zellen und später der Tiere wurdemittels PCR, RT-PCR, Restriktionsverdau und Sequenzierung durchgeführt.Für histologische Untersuchungen wurden Paraffin- sowie Semidünnschnitteund elektronen-mikroskopische Aufnahmen angefertigt.Der Targeting-Vektor wurde in C57/BL6-129sv hybrid ES Zellen eingeführtund die positiven Klone in Blastozysten implantiert. Die Chimären wurdengenotypisiert und in einen BL/6J Hintergrund zurückgekreuzt. HistologischeUntersuchungen der Retinae deuten auf eine fortschreitende Reduktionder Retinadicke hin, außerdem finden sich delokalisierte Nuclei in derSchicht der Inneren Segmente und eine Auflösung der Membrana LimitansExterna. Ab einem Alter von 6 Wochen sind umfassende morphologischeVeränderungen der Photorezeptorzellen zu beobachten.Das neu erzeugte Mausmodell bildet einen degenerativen Phänotyp aus,was auf die Aktivierung eines ähnlichen oder verwandten pathologischenVerlaufs, verglichen mit dem beim Menschen, hindeutet. Dieses Model wirdzukünftig Einblicke in die pathologischen Mechanismen gewähren, die ander retinalen Degeneration beteiligt sind, ebenso wie in die biochemischenGründe für die Toxizität der veränderten Proteine. Es soll jedoch zukünftigauch als Therapiemodell dienen, weshalb eine Erkennungssequenz für dieHomingendonuklease I-SceI integriert wurde, um eine spätere Sequenzreparaturmittels homologer Rekombination an den Chromosomen der Photorezeptorendurchführen zu können.

Mutations in the gene encoding the retinitis pigmentosa GTPase regulator(RPGR) are known to be the dominant cause for X-linked RP in humans.Most of the responsible mutations can be found in a specific, repetitiveregion of the ORF15, which is therefore called the mutation hot spot ofRPGR. There, point mutations are responsible for a frame shift, causing theC-terminal amino acid chain to be modified while potentially causing a toxicgain of function of the mutated protein.The purpose of this work was to develop a mouse model that contains a1 base pair deletion, provoking the change of the amino acids at the Cterminalend of the mouse protein to be similar to the one in mutated humanproteins. The pathological mutation along with additional, silent mutationswhere introduced into murine ES cells using homologous recombination ofa targeting vector. The genotyping of the ES cells as well as the animals wasperformed using PCR, RT-PCR, restriction-digestion and sequencing. In orderto perform the required histological analysis, paraffin sections, semithinsections and electron microscopic images where produced.The targeting vector was introduced into C57/BL6-129sv hybrid ES cellsand positive clones were implanted into surrogate mother mice. Chimericanimals were genotyped and back-crossed into a BL/6J background. Histologicalanalysis of the retina at different ages of the mice revealed a progressivereduction of the retina thickness as well as delocalized nuclei amongthe IS (inner segments) and a disruption of the Outer Limiting Membrane.Beginning at an age of six weeks, severe morphological changes can be observedin the photoreceptors.The mouse model generated in the course of this work shows pathologiessuggesting a disease-progression similar to the one found in human patients.In the future this model will allow us to gain insight into the pathologicalmechanisms responsible for the degeneration as well as the biochemicaltriggers for the toxicity of the mutated proteins. Furthermore, it is designedto be a model for therapeutic approaches since it contains an I-SceIhomingendonuclease recognition site for later sequence repair by homologousrecombination.
Development of a humanized Mouse-Model for X-linked Retinitis Pigmentosa caused by a point mutation in the Rpgr gene
Keywords: ddc:570