Untersuchungen zum Pathomechanismus von Mutationen des humanen BEST1-Gens - Pasquay, Caroline; Justus Liebig University Giessen (My University, 2018)
Das retinale Pigmentepithel (RPE) erfüllt einige wichtige Funktionen in der Versorgung der Photorezeptoren. Dabei besteht eine enge funktionelle Interaktion zwischen den Photorezeptoren und den Zellen des RPE. Bestrophin 1 ist das Genprodukt des BEST1-Gens, welches notwendig für die Kalciumhomöostase der RPE-Zellen ist, indem es als Chloridionenkanal das Gegenion zum Kalzium transportiert, also einen Ionenkanal darstellt. Bestrophin1 wird an der basolateralen Membran des RPE exprimiert und steht so in direktem Kontakt zu den Photorezeptoren (Johnson et al., 2017). Mutationen des BEST1-Gens führen zu verschiedenen Erkrankungen des Auges wie der juvenilen vitelliformen Makuladystrophie nach Best, der adulten vitelliformen Makuladystrophie, der autosomal dominanten Vitreochoroidopathie, der autosomal rezessiven Bestrophinopathie und der Retinitis pigmentosa (Johnson et al., 2017). Die Erkrankungen manifestieren sich durch einen reduzierten Chloridionenfluss und erzeugen reduzierte Ableitungen im EOG (Yu et al., 2007;Sun et al., 2002). Die Mutationen zeigen reduzierte Penetranz und variable Expressivität (Johnson et al., 2017) . Die häufigste Form ist der autosomal dominant vererbte M. Best. Der M. Best zeigt kein einheitliches Alter bei Beginn der Erkrankung und keinen einheitlichen zeitlichen Verlauf der Progression. Oftmals entwickeln Träger ursächlicher Mutationen (z.B. p.N99K, p.D312N oder die Deletionsmutante p.I295del) keine Symptomatik (reduzierte Penetranz). Ziel dieser Arbeit war es, den Pathomechanismus der reduzierten Penetranz für die Missense Mutationen p.N99K, p.D312N und die Deletionsmutante p.I295del zu untersuchen. Dafür wurde zunächst mittels RT-PCR die DNA des BEST1-Gens aus humaner RNA gewonnen. Das Gen wurde in den pCR®2.1TOPO®-Vektor kloniert und mit einem His-Tag versehen. Im Anschluss wurde das His-markierte BEST1-Gen in den pcDNA3.1(+)Expressionsvektor kloniert. Mittels Mutagenese-PCR wurden dann die Mutationen p.D312N, p.N99K und p.I295del eingefügt. Die Konstrukte wurden in MDCK-II-Zellen heterolog exprimiert und immunhistochemisch untersucht. Hier zeigte sich, dass das Wildtyp-Genprodukt wie erwartet, zur Plasmamembran transportiert wurde, während das Genprodukt der p.D312N-Mutation gleichmäßig im Zytoplasma verteilt vorlag, ebenso wie das Genprodukt der p.I295del-Mutation. Das Genprodukt der p.N99K-Mutation lag ebenfalls zytoplasmatisch vor, jedoch in granulären Strukturen. Für die Untersuchung der Interaktion der mutierten Genprodukte mit dem Wildtyp wurde eine MDCK-II-Zelllinie generiert, die ein Myc-Tag markiertes Wildtyp-Bestrophin 1 stabil exprimierte. Diese Zelllinie wurde mit dem His-Tag-markierten hBEST1, das die Mutationen p.D312N, p.N99K und p.I295del trug, transfiziert und die heterologe Expression mit Hilfe der SDS-PAGE im Western Blot mit Myc-und His-Tag-spezifischen Antikörpern dargestellt. Der Proteinnachweis mit dem Myc-Tag spezifischen Antikörper zeigte deutlich geringere Mengen Genprodukt bei Expression der Mutationen p.D312N-His und den Mutationen p.N99K und p.I295del im Vergleich zum Wildtyp-Genprodukt. Mit dem His-Tag-spezifischen Antikörper wurde die Interaktion näher untersucht. Es konnte eine unwesentlich stärkere Expression des Wildtyp-Genprodukts im Vergleich zu den Mutationen nachgewiesen werden. In einer Immunpräzipitation über den His-Tag konnte Myc-Tag-markiertes Wildtyp-Genprodukt mit dem Wildtyp-Genprodukt präzipitiert werden. Mit dem p.D312N-His-Genprodukt konnte Myc-Tag-markiertes Wildtyp-Bestrophin 1 in vergleichbarer Menge isoliert werden. Über die Genprodukte p.N99K-His und p.I295del-His waren kaum nachweisbare Mengen Myc-Tag-markiertes Wildtyp-Bestrophin 1 zu isolieren. Die Gegenprobe mit dem His-Tag spezifischen Antikörper zeigte erneut eine vergleichbare Menge des Wildtyp-Genproduktes und des p.D312N-Genproduktes, wohingegen die Signale der Mutationen p.N99K und p.I2915del schwächer waren. Darüber hinaus wurde eine immunhistochemische Studie durchgeführt. Auch hier konnte eine Kolokalisation der beiden Wildtypproteine nachgewiesen werden. Allerdings war die Lokalisation der Wildtyp-Genprodukte zytoplasmatisch und nukleär und damit nicht physiologisch, da die Zellen die Epithelialisierung noch nicht abgeschlossen hatten. Die Genprodukte der Mutation p.D312N-His lagen um den Zellkern herum und zytoplasmatisch vor. Die Mutation p.N99K lag zytoplasmatisch in granulären Strukturen vor, wurde aber nicht zur Plasmamembran transportiert. Das Wildtypprotein lag vor Allem nukleär vor. Bei der Mutation p.I295del war die Expression des Wildtyp-Bestrophin 1 stark reduziert und das Protein war zytoplasmatisch lokalisiert, während das mutierte Protein stark überexprimiert war und zytoplasmatisch vorlag. Diese Ergebnisse können eine Erklärung für die reduzierte Penetranz, die die Mutationen p.N99K und p.I295del zeigen, darstellen. Ausserdem lassen sie den Schluss zu, dass die Patienten aufgrund von Haploinsuffizienz erkranken.

The retinal pigment epithelium (RPE) performs several important functions in support of the photoreceptor cells. There is a close functional interaction between the photoreceptors and the cells of the RPE. Bestrophin 1 is encoded by BEST1 which is necessary for intracellular calcium signalling in RPE cells because it acts as a chloride channel shuttleling the counter ion for calcium. Bestrophin 1 is localised to the basolateral membrane of RPE cells and thus stands in direct contact with the photoreceptors (Johnson et al., 2017). Mutations in BEST1 cause various retinal diseases such as Best s vitelliform macular dystrophy, adult-onset vitelliform macular dystrophy, autosomal dominant vitreoretinochoroidopathy, autosomal recessive bestrophinopathy and retinitis pigmentosa (Johnson et al., 2017). The diseases are characterised by a reduzed EOG and an abolished or diminished chloride conductance (Sun et al., 2002 ;Yu et al., 2007). The most frequent disorder caused by mutations in BEST1 is the juvenile vitelliform macular degeneration (Best disease), an autosomal dominant maculopathy. There is no common age at onset for Best disease neither is there a constant rate of progression. In some mutations (i.e. p.N99K, p.D312N, and the deletion mutant p.I295del) carriers frequently do not develop symptoms (reduced penetrance). The aim of this study was to investigate the pathomechanism of reduced penetrance in the missense mutations p.N99K and p.D312N and the deletion mutant p.I295del. For this purpose, the cDNA of the BEST1 gene was first obtained by means of RT-PCR from human RPE-RNA. The gene was cloned into the pCR®2.1TOPO® vector and a His-Tag lable was added. Subsequently the BEST1-His construct was cloned into the pcDNA3.1(+) expression vector. Mutations p.N99K, p.D312N and p.I295del were inserted by mutagenesis PCR into the pcDNA3(+)-BEST1-His plasmid. The constructs were heterologously expressed in MDCK-II cells and immunohistochemistry was applied. The gene product of the wildtype construct was localized to the plasma membrane while the p.D312N gene product was distributed evenly in the cytoplasm, as the p.I295del gene product did. The p.N99K gene product also remained cytoplasmic, but localized into granular structures. To investigate the interaction of the wildtype and the mutant gene products a cell line was generated stably expressing a Myc-Tag-labled wildtype Bestrophin 1. This cell line was transfected with the mutant His-tagged constructs and the heterologous expression was probed in SDS-PAGE and Western blot with Myc-tag and His-tag specific antibodies. Immunostaining with a Myc-tag specific antibody revealed less gene product of the wildtype construct upon co-expression with the mutant constructs. Immunostaining for the His-tag revealed a slightly stronger expression of the wildtype construct compared to the mutant constructs. Immunoprecipitation for the His-tag revealed comparable signals for p.D312N-His and the wildtype gene product while for the p.N99K-His gene product and the p.I295del-His only insignificant signals were detected. An interaction between the wildtype gene products could also be shown with the His-tag specific antibody. The interaction between the mutant gene products with the Myc-tagged wildtype Bestrophin 1 gene product was weaker. An immunohistochemical study was performed. Here, a colocalization of the two wildtype gene products could be demonstrated. However, the colocalization was cytoplasmic and nuclear because the cells had not fully completed epithelialization which resulted in non-physiological distribution. The mutation p.D312N-His was present surrounding the nucleus and in the cytoplasma, whereas the wildtype protein was located nuclear but also cytoplasmic and membranous. The mutation p.N99K-His was cytoplasmic and in granular structures. Most of the wildtype gene product remained nuclear. In case of the mutation p.I295 del-His the gene product of the wildtype was strongly attenuated and the protein remained cytoplasmic, whereas the mutant gene product was strongly overexpressed and located in the cytoplasm. These results may provide an explanation for the reduced penetrance shown by the mutations p.N99K and p.I295del. They also suggest that patients are affected due to haploinsufficiency.
Examinations on the pathomechanism of mutations in the human BEST1-gene
Keywords: hBest1; Proteinbiochemie; Pathomechanismus; ddc:610