Etablierung und Charakterisierung einer dreidimensionalen Endothel-Glattmuskelzell-Kokultur zur Untersuchung pulmonaler Angiogenese in vitro - Albrecht, Jens Uwe; Justus Liebig University Giessen (My University, 2006)
Ein Lebewesen ist auf die Entwicklung eines Blutgefäßsystems angewiesen, wenn seine Größe die Versorgung der Zellen mit Sauerstoff und Metaboliten zur Energiegewinnung durch Diffusion von der Oberfläche nicht mehr suffizient zulässt. Angiogenese, das Aussprossen neuer Blutgefäße aus bereits Bestehenden, nimmt dabei eine zentrale Rolle ein. Sie hat ihren Stellenwert nicht nur in der Organentwicklung, sondern ist auch im adulten Organismus präsent z.B. bei Wundheilung, Infektabwehr und dem weiblichen Zyklus, aber auch bei pathologischem Gefäßwachstum wie es bei malignen Tumoren oder der Frühgeborenen-Retinopathie beobachtet wird. Endothelzellen sind die zentralen Protagonisten der Angiogenese, murale Zellen (glatte Muskelzellen und Fibroblasten) haben ebenfalls Einfluss auf Gefäßwachstum und Homöostase. Die Angiogenese der Lungengefäße unterliegt möglicherweise einer besonderen Regulation. Ziel dieser Arbeit war die Untersuchung pulmonaler Angiogenese in vitro an primären humanen pulmonalen Endothelzellen allein und im Verband mit pulmonalen glatten Muskelzellen. Folgende Ziele wurden definiert: 1. Etablierung und Charakterisierung eines in vitro Sphäroidmodells der Angiogenese humaner pulmonaler mikrovaskulärer Endothelzellen allein und in Kokultur mit humanen pulmonalarteriellen glatten Muskelzellen, welches angiogenes Aussprossen in einer dreidimensionalen Gelmatrix ermöglicht. 2. Quantifizierung der Angiogenese des Späroidmodells unter Einsatz validierter angiogener Faktoren. 3. Vergleich der Angiogenese von Endothel-Monokultursphäroiden und Endothel-Glattmuskelzell Kokultursphäroiden. 4. Vergleich der Angiogenese systemischer mikrovaskulärer Endothelzellen und pulmonaler mikrovaskulärer Endothelzellen. Das Sphäroidmodell wurde als zuverlässiger und gut reproduzierbarer in vitro Assay etabliert. Die Quantifizierung der angiogenen Endothelsprossen erfolgte mittels eines mikroskopischen Video-Imaging Systems und selbst erstellter Software semi-automatisiert. Die kapillaren Sprossen im dreidimensionalen Gel wurden immunhistologisch als Endothelzellen bzw. Endothelzellen mit peripheren, stabilisierenden glatten Muskelzellen charakterisiert. Es zeigte sich hierbei eine gute Analogie zur in vivo Angiogenese.Humane pulmonale mikrovaskuläre Endothelzellen zeigten sowohl Spontanangiogenese als auch Wachstumsfaktor -induzierte Angiogenese (VEGF, bFGF, TGF-beta). Die zelluläre Interaktion von pulmonalen Endothelzellen und glatten Muskelzellen veränderte die in vitro Angiogenese. Die Wachstumsfaktor-induzierte Angiogenese der Kokultursphäroide aus Endothelzellen und Glattmuskelzellen war reduziert gegenüber der der Endothel-Monokultursphäroide. Des Weiteren wurde ein signifikant stärkerer angiogener Effekt von TGF-beta bei durch VEGF- bzw. bFGF- stimulierten Kokultursphäroiden als bei ebenso stimulierten Monokultursphäroiden beobachtet. Damit konnte die Interaktion von Endothelzellen und glatten Muskelzellen bei der Angiogenese einem bestimmten Wachstumsfaktor zugeordnet werden. Ein Unterschied der in vitro Angiogenese systemischer und pulmonaler Endothelzellen zeigte sich nicht. Die Herauslösung der Endothelzellen aus dem gesamten Organverband könnte hierfür ursächlich sein, weiterführende Untersuchungen in dieser Richtung sind notwendig um Organ-abhängige Unterschiede der Angiogenese zu zeigen. Zusammenfassend ist es gelungen, ein Sphäroidmodell zur Untersuchung pulmonaler Angiogenese in vitro zu etablieren, und eine Basischarakterisierung dieses Modells vorzunehmen.

An organism becomes dependent on the development of a vascular system when its size constricts sufficient supply of the cells with oxygen and metabolites by diffusion. Angiogenesis, i.e. the sprouting of new vessels from existing vasculature, is a central mechanism in organ development and repair. It was not only shown to be important for organogenesis, but it is prevailing in adult organisms for example in wound healing, immune defense and the female cycle but also in pathologic vessel growth, malignancies and the retinopathy of prematurity. Endothelial cells play a central role in angiogenesis but other vascular cells (smooth muscle cells and fibroblasts) also influence vessel growth and homeostasis. Potentially, angiogenesis of pulmonary vessels is differentially regulated compared to vessels of the systemic circulation. The Aim of this study was the investigation of pulmonary angiogenesis in vitro using pulmonary endothelial cells alone and in association with smooth muscle cells. The following aims were addressed: 1.) Establishment and characterization of an in vitro spheroid-model for angiogenesis of human pulmonary microvascular endothelial cells alone and in coculture with human pulmonary artery smooth muscle cells, which allows angiogenic sprouting in a three-dimensional gel matrix. 2.) Quantification of the angiogenic response in the spheroid model using validated angiogenic growth factors. 3.) Comparison of the angiogenesis of endothelial cell monoculture-spheroids and endothelial-smooth muscle cell coculture-spheroids. 4.) Comparison of the angiogenesis of systemic microvascular endothelial cells and pulmonary microvascular endothelial cells. The spheroid model was established as a reliable and well reproducible in vitro assay. Quantification of angiogenic endothelial sprouting was performed in a semi-automatic manner using a microscopic imaging system and customized software. Capillary sprouts in the three-dimensional gel matrix were immunohistologycally characzerized and consisted of endothelial cells or endothelial cells with peripherally located, stabilizing smooth muscle cells, showing good similarity to in vivo angiogenesis. Human pulmonary microvascular endothelial cells underwent spontaneous angiogenesis as well as growth factor-induced angiogenesis (VEGF, bFGF, TGF-beta) in this model. The cellular interactions of pulmonary endothelial cells and smooth muscle cells influenced the in vitro angiogenesis: growth factor-induced angiogenesis of coculture-spheroids composed of endothelial cells and smooth muscle cells was reduced in comparison to pure endothelial cell spheroids. Furthermore, a significantly stronger angiogenic effect of TGF-beta on VEGF- and bFGF-stimulated coculture-spheroids than on analogically stimulated monoculture-spheroids was observed. This finding suggested intercellular interactions between endothelial cells and smooth muscle cells that regulate angiogenesis in response to TGF-ß. A significant difference of angiogenesis bewteen systemic and pulmonary endothelial cells could not be detected. Extraction of the endothelial cells out of their original environment may be causative for this. To address organ-dependent differences in angiogenesis, further studies will be necessary. Summarizing, this study documents the successful establishment and fundamental characterization of a spheroid model to investigate pulmonary angiogenesis in vitro.
Establishment and characterization of a threedimensional endothelium-smooth muscle cell coculture to investigate pulmonary angiogenesis in vitro
Keywords: Angiogenese; Endothel; Glattmuskelzelle; Kokultur; Angiogenesis; endothelium; smooth muscle cell; coculture; ddc:610