Molekulare Charakterisierung pathogener Succinat-Semialdehyd-Dehydrogenase-Varianten - Füssgen, Vera Simone; Justus Liebig University Giessen (My University, 2022)
Der SSADH-Mangel ist eine autosomal-rezessiv vererbte Störung des GABA-Stoffwechsels, die durch Mutationen im ALDH5A1-Gen verursacht wird. Das klinische Erscheinungsbild ist unspezifisch. Bisher erfolgt die Therapie des SSADH-Mangels symptomatisch. Dabei steht vor allem die Behandlung von Krampfanfällen oder neurologischen Verhaltensstörungen im Vordergrund. Die Etablierung einer kurativen oder auf SSADH gezielten Therapie spielt daher eine große Rolle in der Forschung am SSADH-Mangel. Für die Etablierung innovativer Therapieansätze, wie pharmakologische Chaperone, ist es wichtig, zu wissen, inwieweit die pathogenen Varianten des ALDH5A1-Gens einen Einfluss auf die SSADH-Expression und -Aktivität haben. Deshalb wurden in dieser Arbeit SSADH-Missense-Varianten mithilfe des Western Blots und eines Fluoreszenz-basierten SSADH-Aktivitätsassays charakterisiert. Um ein besseres Verständnis über die Pathophysiologie der Erkrankung zu bekommen, wurden zudem die subzelluläre Lokalisation der SSADH-Varianten sowie das Aussehen der Mitochondrien in immunfluoreszenz-gefärbten Zellen untersucht. Dabei zeigte sich, dass bei allen untersuchten Varianten des ALDH5A1-Gens SSADH exprimiert wurde und in die Mitochondrien gelangte. Allerdings war die SSADH-Menge bei der Variante Gly284Asp vermindert. Die Aktivität war bei allen untersuchten SSADH-Missense-Varianten tiefgreifend reduziert. Dadurch akkumulierten wahrscheinlich toxische Metaboliten, die zu der mithilfe der Immunfluoreszenzfärbung beobachteten Schädigung der Mitochondrien beitrugen. Die Charakterisierung der SSADH-Missense-Varianten erfolgte in einem transienten Transfektionsmodell mit HEK293T-SSADH-KO-Zellen. Um ein stabiles Transfektionsmodell zu generieren, wurde aus der Flp-InTM HEK293-Zelllinie das endogene ALDH5A1-Gen ausgeknockt. Anschließend wurde das Wildtyp-ALDH5A1-Gen in das Genom der Zellen integriert, um stabil SSADH exprimierende Zellen zu generieren. In Zukunft könnten SSADH-Missense-Varianten mithilfe dieses Systems untersucht werden, um weitere Erkenntnisse über die Pathogenese zu gewinnen. Dafür wurden bereits acht bei SSADH-Mangel vorliegende Missense-Mutationen in das zum Flp-InTM System gehörende Expressionsplasmid eingebaut und mittels transienter Transfektion auf ihre Funktionalität überprüft. Als nächstes können die SSADH-Missense-Varianten stabil in Flp-InTM HEK293-SSADH-KO-Zellen exprimiert und anschließend detaillierter charakterisiert werden. Durch die genauere Charakterisierung der SSADH-Varianten könnten künftig möglicherweise personalisierte Therapiemöglichkeiten für jeden einzelnen Erkrankten identifiziert und etabliert werden.
Keywords: Succinat-Semialdehyd-Dehydrogenase-Mangel; SSADH; ddc:610