Entwicklung eines programmierbaren Restriktionsenzyms - Eisenschmidt, Kristin; Justus Liebig University Giessen (My University, 2005)
In der vorliegenden Arbeit sollte die Spezifität der Restriktionsendonuklease scPvuII durch Kopplung mit der Spezifität eines TFOs (triple-helix forming Oligonukletids) erweitert werden. Hierfür wurde zuerst die scPvuIIH6G4C-Variante exprimiert und über Affinitätschromatographie gereinigt. Die DNA-Bindungseigenschaften dieser Variante wurden anschließend mit und ohne den Kofaktor Mg2+ mit Hilfe von Fluoreszenz-Anisotropie-Messung bestimmt. Anschließend wurde ein TFO mit dem C-terminalen Ende der scPvuIIH6G4C-Variante unter Verwendung des bifunktionalen Crosslinkers GMBS kovalent verknüpft. Dessen mit N-Hydroxysuccimid aktivierte Carboxylatgruppe reagiert mit der NH2-Gruppe des TFOs unter Ausbildung einer Amidbindung. Nach Entfernung des überschüssigen Crosslinkers durch Gelfiltration konnte das TFO-GMBS Konstrukt in einer zweiten Reaktion mit dem C-terminalen Cystein des Proteins über eine Thioetherbindung kovalent verbunden werden. Von dem so hergestellten TFO-scPvuII-Heterokonjugat musste anschließend ungekoppeltes, freies scPvuII abgetrennt werden, da dieses mit der adressierten Spaltung des TFO-scPvuII Konstruktes durch nicht-adressierte Spaltung interferieren würde. Diese Abtrennung erfolgte mittels Anionenaustauschchromatographie. Die nahezu 100 %ige Reinheit des gereinigten TFO-scPvuII-Heterokonjugates konnte über SDS-PAGE gezeigt werden. Parallel dazu wurden die Bindungseigenschaften verschiedener TFOs hinsichtlich ihrer triple-helix-Bildung mit Hilfe verschiedener Untersuchungsmethoden, z.B. 'electrophoretic mobility shift assay', 'cleavage protection assay' und 'circular dichroism', charakterisiert und für die Anwendung unter physiologischen Bedingungen optimiert. Nachdem die optimalen Bedingungen zur Ausbildung einer triple-helix gefunden worden waren und das TFO-scPvuII-Heterokonjugat gereinigt vorlag, konnten Experimente zur adressierten Spaltung von PCR-Substraten durchgeführt werden, wobei die Mg2+-Konzentration, die Linker-Länge des Heterokonjugates, der Abstand zwischen adressierter PvuII-Spaltstelle und triple-helix Bindungsstelle und die Ionenstärke variiert wurden. In diesen Experimenten wurde eine optimale Mg2+-Konzentration von 1,25 mM ohne NaCl bzw. 2,5 mM mit 100 mM NaCl, sowie ein Optimum der Linker-Länge von 12 Methylengruppen (C12-Linker) und ein Abstand von 9 bp zwischen TFS und der adressierten Spaltstelle gefunden. Unter diesen optimalen Bedingungen konnten Spaltpräferenzen im dreistelligen Bereich zwischen adressierten und nicht-adressierten PvuII-Spaltstellen gemessen werden. Spaltexperimente mit makromolekularen Substraten (supercoil und linearer Plasmid-DNA), sowie in Kompetition mit einem hohen Überschuss an & #955;-DNA bestätigten die hohe Präferenz für adressierte Spaltstellen durch das Konjugat. Als erste Experimente für in vivo Applikationen wurden Kernlokalisationsexperimente durchgeführt. Hier konnte gezeigt werden, dass transient exprimierte scPvuII-Varianten mit einem NLS in den Nukleus transportiert werden können. Diese Ergebnisse sollen später auf das TFO-scPvuII-Heterokonjugat erweitert werden, wenn das Konjugat für adressierte Spaltexperimente in vivo angewendet werden soll.In der vorliegenden Arbeit wurde ein TFO-Restriktionsendonuklease-Heterokonjugat entwickelt, das gezielt und hochspezifisch zur adressierten Spaltung von DNA in vitro eingesetzt werden kann. Dabei hat sich herausgestellt, dass die Mg2+-Konzentration, die Salzkonzentration, die Länge des Linkers, der TFO und Protein verbindet, und der Abstand zwischen triple-helix Bindungsstelle und PvuII-Spaltstelle einen wesentlichen Einfluss auf die Erreichbarkeit der zur triple-helix Bindungsstelle direkt benachbarten PvuII-Schnittstelle und damit auf die Spaltaktivität des Konjugates haben. Dieses Heterokonjugat hat aufgrund seiner hohen Spezifität und der flexiblen Kombinierbarkeit verschiedener TFOs mit verschiedenen Restriktionsenzymen enormes therapeutisches Potential und kann nun für in vivo Applikationen weiter charakterisiert werden.
Keywords: adressierte Spaltung; Restriktionsendonuklease; triple helix; ddc:570