Mutationsanalyse eukaryoter Gene : BRCA-Genomanalyse von 35 Familien mit Mamma- und/oder Ovarialkarzinomen mit vergleichenden Studien über unterschiedliche Analyseverfahren - Bongard, Helene; Justus Liebig University Giessen (My University, 2003)
Um ein selektives Mutationsanalyse-Verfahren für BRCA1, eines der Gene, das für erblichen Brust-Eierstockkrebs verantwortlich ist, zu entwickeln, wurden 35 Patientinnen aus Bulgarien sowie 70 normale Kontrollpatientinnen untersucht. Die Patientinnen, die gezielt mit Hinblick auf familiären Brustkrebs/Eierstockkrebs ausgesucht wurden, wurden zuerst mit Hilfe des PTT komplett untersucht, um eventuell vorliegende 'Nonsense'-Mutationen zu entdecken. Da diese Untersuchung negativ ausfiel, wurde das weitere Screening mit Hilfe von drei verschiedenen SSCP-Formaten (SSCP, PEG-SSCP, MDE-SSCP) und CSGE fortgesetzt. Das CSGE-Protokoll wurde für diese Untersuchung optimiert. In dieser Studie wurden 12 Sequenzvariationen nachgewiesen, davon 11 Nukleotidsubstitionen sowie eine Deletion. Zwei dieser Variationen sind intronische Polymorphismen, die restlichen zehn liegen innerhalb der Exons. Von den nachgewiesenen 12 Polymorphismen sind 11 in der Literatur bereits beschrieben, einer ist neu. Alle Sequenzvariationen wurden mit Hilfe von CSGE, und acht der Polymorphismen ebenfalls mit Hilfe der SSCP entdeckt. Keine der Sequenzvariationen konnte allein durch SSCP-Analyse identifiziert werden. Aufgrund der spezifischen Sequenzabberationen (Nukleotidsubstitutionen) und des vergleichsweise hohen Prozentsatzes von AT (58,4%) im BRCA1-Gen stellt CSGE die sensitivere Methode dar. Diese Schlussfolgerung steht in Einklang mit anderen strategischen Analysen für BRCA1, und diese Tatsache kann weiterhin für die Mutations-Analyse von AT-reichen, multi-Exon Genen wichtig sein. Die Untersuchung von fünf bekannten Polymorphismen von Exon 11 bis Exon 16, die zu Aminosäure-Austauschen führen (Aminosäure-Position 871, 1038, 1183, 1431 und 1613) ergaben zwei distinkte Haplotypen, genannt BRCA1 und BRCA1*. Um das Kopplungs-Ungleichgewicht der Probanden zu untersuchen, die für alle Polymorphismen heterozygot sind, wurde die 'primer-aided allele-specific Amplifikation' (PASA) in Exon 11 (Aminosäure 871, 1038 und 1183) durchgeführt. Während BRCA1 das translatierte Produkt des BRCA1-Allels repräsentiert, führen die fünf Nukleotidsubstitutionen in BRCA1* zu Aminosäure-Austauschen in den oben genannten Positionen. Dieses ergibt eine molekular unterschiedliche BRCA1-Isoform, BRCA1*. Die errechnete Allel-Frequenz für BRCA1* beträgt 0,36 in der Kontrollgruppe (95% confidence interval (CI) 0,32-0,40) und 0,21 in der Patientinnengruppe (95% CI 0,17-0,26). Das seltenere Vorkommen des BRCA1*-Allels bei den Brustkrebspatientinnen könnte einen Populationsunterschied darstellen, oder auf eine benachteiligende/beschützende Funktion in der Entwicklung von Krebs hinweisen. Die Bedeutung dieses seltenen Haplotyps für den normalen, bzw. für den Brustkrebs-Phänotyp bleibt ein Thema weiterer Studien.

In order to develop a selective mutation screening strategy for BRCA1, one of the genes responsible for hereditary predisposition to breast cancer, we analysed by ngle-strand conformation polymorphism (SSCP) and conformation-sensitive gel electrophoreses (CSGE) a cohort of 35 Bulgarian breast cancer patients, as well as 70 normal controll patients, prescreened for nonsense mutations by the protein truncation test. By assaying the complete coding sequence of the gene applying both methods, we were able to detect 12 sequence alterations: 11 nucleotide substitutions and one deletion. Two of the alterations are intronic polymorphisms, the rest are exon sequence variants. Of the 12 polymorphisms identified, 11 are already described and one is new. All sequence changes were detected by CSGE and eight of them were also shown by SSCP analysis. There was no sequence alterations wich could be detected by SSCP analysis only. CSGE turned out to be e more sensitive technique in our assay. We propose that because of the specifity of most sequence variants detected (nucleotide substitutions) and the comparatively high percentage of AT content of the BRCA1 gene (58,4%). This observation is in agreement with other accepted strategies of analysis for BRCA1 and it may prove useful for mutation screening of AT-rich, multi-exon genes (115). Studying the distribution of five common, amino-acid changing polymorphisms from exon 11 to exon 16 (amino acid positions 871, 1038, 1183, 1431 and 1613), we obtained only two major haplotypes designated as BRCA1 and BRCA1*. To test linkage disequilibrium in probands heterozygous for all polymorphic sites, primer-aided allele-specific amplification (PASA) was performed in exon 11 (aminoacids 871, 1038, 1183). While BRCA1 represents the translation product of the BRCA1 allele, the five nucleotide substitutions detected in BRCA1* resulting in amino acid changes at the positions indicated above give rise to a molecularly distinct BRCA1 isoform, BRCA1*. Obtained allele frequencies for BRCA1* were 0,36 in the control group (95% confidence interval (CI) 0,32-0,40) and 0,21 among breast cancer patients (95% CI 0,17-0,26). The underrepresentation of the rare allele among breast cancer patients could be indicative for a populational difference or disadvantage/protective function in the development of cancer. What is the importance of the rare haplotype for the normal, respectively the breast cancer phenotype remains a subject of further studies.
Mutation detection of eukaryotic genes : BRCA genomic analysis in 35 breast -and/or ovarian cancer families and the comparison of different mutation screening methods
Keywords: BRCA1; Brustkrebsgen; Mutationsanalyse; erblicher Brustkrebs; BRCA1; breast cancer gene; mutation detection; hereditary breast cancer; ddc:630