Bakterielle Expression eines codon-optimierten Flotillin-1-Fusionsproteins - Shams Ashaghi, Negin; Justus Liebig University Giessen (My University, 2025)
Das humane Flotillin-1-Protein ließ sich bislang in Prokaryoten nicht gut exprimieren. Der Grund könnte die unterschiedliche Codonbenutzung in Pro- und Eukaryoten sein. Um für Forschungszwecke mehr lösliches Flotillin-1 als GST-Fusionsprotein zu gewinnen, war das Ziel dieser Arbeit „codon-optimierte“ Flotillin-1 Expressionsplasmide zu generieren, diese hinsichtlich Expression und Kulturbedingungen zu untersuchen und zu optimieren, sodass die höchstmögliche Proteinausbeute geschaffen wird. Dabei sollten, nach Optimierung des Leserasters des humanen Flotillin-1 für die bakterielle Expression, die Parameter Temperatur, Induktionszeit und -konzentration untersucht und optimiert, sowie die Expression des optimierten Flot-1-GST Fusionsproteins mit der nicht optimierten Sequenz verglichen werden. Für die Expressionsversuche wurde das codon-optimierte Flotillin-1 als GST-Fusion in den Vektor pGEX-4T-1 kloniert. Nach ersten Expressionsversuchen mit einer 0,2 mM IPTG-Induktion über Nacht und bei Raumtemperatur in den dafür geeigneten kompetenten Zellen BL21, konnte mittels SDS-Gelelektrophorese und Western Blot das expressionsstärkste Klon detektiert werden. Mit diesem wurden alle folgenden Versuche durchgeführt. Es wurden lediglich Vorversuche durchgeführt, um zunächst eine Tendenz zu ermitteln, ob die Optimierung gewinnbringend ist. Als Wirte für das Fusionsprotein dienten BL21-Zellen, nachdem zwischen der Expression in Rosetta DE3 und BL21 DE3 kein deutlicher Unterscheid festgestellt werden konnte. Das humane Flotillin-1 wurde in Rosetta DE3-Zellen exprimiert. Im Rahmen der Expressionsversuche konnte festgestellt werden, dass die IPTG-Konzentration keinen ausschlaggebenden Unterschied bei der Proteinexpression zeigte. Die Untersuchung der Induktionstemperatur konnte aber recht deutlich zeigen, dass die optimale Temperatur zwischen 21°C und 24°C liegt. Was den Vergleich des optimierten mit dem nicht-optimierten Flotillin-1 angeht, so konnte festgestellt werden, dass das optimierte Protein zwar etwas länger braucht, jedoch am Ende das expressionsstärkere Protein ist. Besonders in großen Mengen kann das optimierte Flotillin-1 durchaus von Vorteil sein, jedoch bringt das nicht-optimierte Flotillin-1 auch gute und zufriedenstellende Ergebnisse bei optimierten Expressionsbedingungen (Temperatur, IPTG-Konzentration und Zeit).
Keywords: Flotillin; Codon-Optimierung; Bakterielle Expression; ddc:610; ddc:500