Eine Untersuchung von zwei Tiermodellen auf ihre Eignung für Studien der Spermatogenese (Weißbüschelaffe, Callithrix jacchus) und der frühen Embryonalentwicklung (Rind, Bos taurus) des Menschen - Hecht, Nadine; Justus Liebig University Giessen (My University, 2010)
Der Histon-Protamin-Austausch ist nicht nur für die männliche Fertilität und dieBefruchtungsfähigkeit der Spermatozoen von entscheidender Bedeutung, sondern er scheintauch einen Einfluss auf die Qualität und die Entwicklung von Embryonen zu haben. DerHiston-Protamin-Austausch wird durch eine Histonacetylierung eingeleitet und erfolgt beimMenschen nur zu etwa 85%. Man nimmt an, dass die acetylierten Resthistone inSpermatozoen als epigenetische Signale eine wichtige Rolle für die früheEmbryonalentwicklung spielen. Zahlreiche Untersuchungen zum Histon-Protamin-Austauschwährend der Spermatogenese beim Mensch existieren bereits und liefern wertvolleInformationen in Bezug auf die Befruchtungsfähigkeit von Spermatozoen. Da menschlicheEmbryonen aus ethischen Gründen nicht für wissenschaftliche Untersuchungen zurVerfügung stehen, sind weiterführende Untersuchungen, die die frühe Embryonalentwicklungbetreffen, am Mensch nicht möglich. Aus diesem Grund lag der Fokus dieser Arbeit auf derEtablierung eines Tiermodells für die Spermatogenese und die frühe Embryonalentwicklungdes Menschen. Im ersten Teil dieser Studie sollte geklärt werden, ob sich der Weißbüschelaffe(Callithrix jacchus) als Tiermodell für die Spermatogenese des Menschen eignet. Hierzuführten wir in-situ Hybridisierungen gegen Protamine und immunhistochemischeUntersuchungen gegen spezifisch an Lysin5 (H4K5ac) Lysin 8 (H4K8ac), Lysin 12 (H412ac)und Lysin 16 (H4K16ac) acetyliertem Histon H4 an Biopsiematerial des Hodens von Menschund Callithrix jacchus durch und analysierten anschließend das Expressionsmuster. Da dieProtamin-1 Sequenz bei Callithrix jacchus noch nicht bekannt war, stellten wir zuerst eineSonde her. Protamine-1 (PRM-1) und Protamin-2 (PRM-2) waren in runden undelongierenden Spermatiden detektierbar. Alle Antikörper gegen acetyliertes Histon H4zeigten in runden und elongierenden Spermatiden positive Signale. H4K8ac und H4K16aczeigten zusätzlich in Spermatogonien des Menschen positive Signale, während beimMarmoset H4K8ac und H4K12ac in diesen Zellen detektierbar waren. Der Antikörper gegenH4K16ac zeigte beim Menschen bereits in den pachytänen Spermatozyten beginnend inStadium III der Spermatogenese eine positive immunhistochemische Reaktion. Zusätzlich zuHodenbiopsien führten wir immunhistochemische Untersuchungen an Ausstrichen vonejakulierten Spermatozoen von Mensch und Callithrix jacchus durch. Alle Antikörper zeigteneine positive Reaktion, jedoch variierte der prozentuale Anteil an positiven Spermatozoendeutlich zwischen den vier eingesetzten Antikörpern. Western Blot Analysen vonhomogenisiertem Ejakulat des Menschen und Callithrix jacchus mit den vier Antikörpernkonnten in beiden Spezies spezifische Banden feststellen. Die Präsenz von spezifisch an Lysin5, 8, 12 und 16 acetyliertem Histon H4 in Spermatozoen beider Spezies zeigt, dass derHiston-Protamin-Austausch nicht vollständig ist. Dies war beim Menschen bereits bekanntund konnte in dieser Untersuchung auch für den Weißbüschelaffen gezeigt werden. Aufgrundder Tatsache, dass der Mensch und der Weißbüschelaffe eine ähnliche Organisation desKeimepithels aufweisen, der Histon-Protamin-Austausch bei Beiden nicht vollständig ist,beide Spezies PRM-1 und PRM-2 exprimieren, und eine gleiche Expression von PRM-1 undPRM-2 mRNA in runden und elongierenden Spermatiden zeigen, eignet sich derWeißbüschelaffe als Tiermodell für den Histon-Protamin-Austausch im Menschen. Daacetylierte Histone in Spermatozoen im Verdacht stehen mit Genen assoziiert zu sein, die denStart der Transkription und die frühe Genexpression in der Zygote bedingen, also vomSpermatozoon auf die Eizelle bei der Befruchtung übertragen werden, eignet sich derWeißbüschelaffe unter Umständen auch als Tiermodell für die frühe Embryonalentwicklungdes Menschen.In einem zweiten Teil dieser Studie wurde das Expressionsmuster von acht Genen inSpermatozoen, Oozyten, Zygoten, 2-Zell und 4-Zell Embryonen von Callithrix jacchus undBos taurus mittels RT-PCR analysiert: Protamine-1 (PRM-1), Protamine-2 (PRM-2), HistonH1 (H1), Histon H3 (H3), Histon H4 (H4), cAMP-responsive element modulator (CREM),DNA Methyltransferase 1 (DNMT1) und TATA box-binding Protein (TBP). Unser Ziel war esspermienspezifische Transkripte zu identifizieren, die vom Spermium auf die Oozyte währendder Fertilisierung übertragen werden. Es ist bekannt, dass diese Gene eine wichtige Rollewährend der Spermiogenese und frühen Embryonalentwicklung spielen. In Callithrix jacchusund Bos taurus zeigten unsere Ergebnisse, dass PRM 1 Transkripte von Spermatozoen auf dieOozyte übertragen werden. Mit unseren Ergebnissen bekräftigen wir die Hypothesen andererStudien, dass das Spermium mehr als nur Überbringer des männlichen Genoms ist, sondernauch spermienspezifische Transkripte während der Fertilisierung auf die Oozyte überträgt, diefür die frühe Embryonalentwicklung essentiell sind.

Histone to protamine exchange is not only essential for male fertility and fertilizing capacityof the spermatozoon, but is also thought to be of great importance for the quality anddevelopment of the embryo. Histone acetylation is a prerequisite for correct histone toprotamine exchange, which in man is only 85% complete. Spermatozoa are transcriptionallyinactive cells, but contain histones normally a characteristic of transcriptionally active cells. Itis postulated that these remaining histones in spermatozoa, which are known to be highlyacetylated, represent epigenetic marks that are transmitted to the oocyte and may be involvedin starting gene expression in the zygote and in regulating gene expression during earlyembryogenesis. Many studies on histone to protamine exchange during spermiogenesis inman exist and deliver valuable information concerning fertilizing competency of spermatozoa.While mRNAs in the oocyte are known to play an important role in both the zygote and earlyembryo, to date, our information on the role of mRNAs in spermatozoa is only scarce. Ananimal model is needed to be able to further investigate in this matter. For this reason, the firstmain issue of this study was to establish an animal model for investigations on humanspermatogenesis and later on early embryo development which, in man, are not possible dueto ethical reasons.In the first part of this study, we wanted to elucidate, if the marmoset (Callithrix jacchus) mayrepresent a suitable animal model for human spermatogenesis. For this purpose, we used insituhybridization and immunohistochemistry to analyze expression of protamine 1 (PRM-1)and protamine 2 (PRM-2), and histone H4 specifically acetylated at lysine 5 (H4K5ac), 8(H4K8ac), 12 (H4K12ac) and 16 (H4K16ac) in human and marmoset testes and ejaculates. Asthe DNA sequence of protamine 1 from Callithrix jacchus was not known, we first amplifiedmarmoset protamine 1 from marmoset testes cDNA. PRM-1 and PRM-2 mRNA was presentin round and elongating spermatids. All antibodies against acetylated histones revealedpositive signals in these cells. Human spermatogonia showed positive signals for H4K8ac andH4K16ac, whereas marmoset-spermatogonia were positive for H4K8ac and H4K12ac. Inman, H4K16ac displayed a positive immunoreaction already with pachytene spermatocytesstarting at stage III of the seminiferous epithelial cycle. All antibodies showed positiveimmunostaining in ejaculated spermatozoa showing great variability between the fourantibodies and between the two species. Western blot analyses of protein extracts fromejaculated spermatozoa of human and Callithrix jacchus using the four antibodies was alsoperformed and we observed specific bands for all four antibodies in both species. Thepresence of histone H4 specifically acetylated at lysine 5, 8, 12 and 16 in spermatozoa of bothspecies shows that histone to protamine exchange is incomplete. This was already known forman, but has now been demonstrated to be also true for the marmoset. This, and the fact thathuman and marmoset exhibit a similar organization of the seminiferous epithelium, anidentical expression pattern of PRM-1 and PRM-2 mRNA in round and elongating spermatidsand similar expression of specifically acetylated histone H4, we come to the conclusion thatthe common marmoset represents a suitable animal model for studies on histone andprotamine expression during human spermatogenesis. As acetylgroups are thought torepresent epigenetic marks that are transmitted to the oocyte by the spermatozoon duringfertilization and the fact that acetylated histones are present in spermatozoa of the commonmarmoset, this might also make him a suitable animal model for comparative studies on therole of spermatozoa derived mRNAs for embryonic development and early gene expression inman.In the second part of this investigation, we performed RT-PCR in Callithrix jacchus and Bostaurus spermatozoa, oocytes, zygotes, 2-cell and 4-cell embryos to evaluate the presence ofspecific transcripts known to play an important role during fertilization and early embryodevelopment, namely protamine 1 (PRM-1), protamine 2 (PRM-2), histone H1 (H1), histoneH3 (H3), histone H4 (H4), cAMP-responsive element modulator (CREM), DNAmethyltransferase 1 (DNMT1) and TATA box-binding protein (TBP). The goal of this part ofthe study was to identify sperm-specific transcripts. Our data suggest that, in both Callithrixjacchus and Bos taurus, PRM-1 transcripts are delivered from the spermatozoon to the oocyte.With results from this study, we affirm the hypothesis of other studies, that sperm contributemore than just their genome to the oocyte upon fertilization and that sperm-specific transcriptsexist and are essential for fertilization and early development and gene expression of theembryo.
Keywords: ddc:630