YB-1 inhibiert die durch TGF-beta1 induzierte Apoptose und die alpha-adrenerg induzierte Hypertrophie in Kardiomyozyten - Harjung, Claudia; Justus Liebig University Giessen (My University, 2012)
Infolge einer längeren Druckbelastung des Herzens kommt es zu einem Übergang des adaptiven, hypertrophen Wachstums zur Entwicklung einer Herzinsuffizienz. Diese geht unter anderem mit einer erhöhten TGFbeta1-Expression sowie mit einer Apoptose-Induktion einher. Während dieser Prozesse wird im Herzen eine Aktivierung von SMAD- und AP-1-Transkriptionsfaktoren gefunden, die Einfluss auf Hypertrophie- und Apoptose-Prozesse haben. Der Transkriptionsfaktor YB-1 kann sowohl mit SMADs als auch mit AP-1 interagieren und somit Gene regulieren, die für diese Prozesse verantwortlich sind. Da eine Überexpression von YB-1 in Kardiomyozyten der adulten Ratte einen hemmenden Einfluss auf eine durch TGF-beta1 induzierte Apoptose sowie auf eine α-adrenerg induzierte Hypertrophie hat, war es Ziel dieser Arbeit, die Funktion von YB-1 bei Apoptose- und Hypertrophie-Vorgängen in Herzmuskelzellen zu untersuchen. Ergänzend zu adulten Kardiomyozyten sollten H9c2-Zellen als Modell für eine YB-1 Überexpression etabliert und der TGF-beta-Signalweg in dieser Zelllinie analysiert werden.Eine Infektion von H9c2-Zellen mit AdYB-1 (500 MOI) erhöhte die relative YB-1-mRNA-Expression nach 24 h und die relative YB-1-Protein-Expression nach 24 h, 36 h und 48 h signifikant. Mit Hilfe einer Immunfluoreszenz wurde eine vorrangig nukleäre Lokalisation von YB-1 in H9c2-Zellen nachgewiesen. Eine einstündige TGF-beta1-Stimulation (1 ng / ml) führte in H9c2-Zellen zu einer Phosphorylierung von SMAD2 und SMAD3 und zu einer Komplexbildung von P-SMAD2 mit P-SMAD3. Nach 24 Stunden TGF-beta1-Stimulation konnte eine signifikante Steigerung der Expression des SMAD7-Target-Gens beobachtet werden. Eine TGF-beta1-Stimulation führte in H9c2-Zellen zu Apoptose-Induktion.In adulten Kardiomyozyten induzierte eine TGF-beta1-Stimulation in YB-1 überexprimierenden Zellen eine signifikante Verringerung der SMAD4-, JunB- und JunD-mRNA-Expression. Die SMAD7-Expression wurde unter YB-1-Überexpression auf mRNA- und Protein-Ebene signifikant gesteigert. Die Veränderungen der SMAD- und Jun-Expressionen sind hier ein wahrscheinlicher Mechanismus für die anti-apoptotische Wirkung von YB-1 in adulten Kardiomyozyten. Die kombinierte TGF-beta1-Gabe und YB-1-Überexpression führte weiterhin zu einer signifikant vermehrten zytoplasmatischen Lokalisation von YB-1 in H9c2-Zellen.Nach Stimulation mit dem pro-hypertrophen α-Adrenozeptoragonist Phenylephrin (10 µM) kam es in adulten Kardiomyozyten sowohl in der Kontrollgruppe, als auch in der mit AdGFP (1000 MOI) infizierten Gruppe zu einer signifikanten Vergrößerung der Zellquerschnittsfläche sowie der relativen 14C-Proteinbiosynthese-Rate. Eine YB-1-Überexpression hemmte die Hypertrophie-Induktion signifikant. Eine YB-1-Infektion erhöhte die relative RGS2-mRNA-Expression, einem Inhibitor der G-Protein-vermittelten Signalkaskade, in Kardiomyozyten unter gleichzeitiger PE-Induktion signifikant. Ebenso steigerte eine YB-1-Überexpression in H9c2-Zellen die relative RGS2-Protein-Expression unter gleichzeitiger PE-Induktion. Eine alleinige YB-1-Überexpression erhöhte die Protein-Expression des anti-hypertrophen SMAD4-Moleküls in Kardiomyozyten und H9c2-Zellen signifikant. Eine alleinige YB-1-Überexpression führte in adulten Kardiomyozyten zu einer signifikanten Erhöhung der mRNA-Expression des JunD-Moleküls, das unter PE anti-hypertrophe Wirkungen vermittelt. Die PE-Gabe in YB-1 überexprimierenden H9c2-Zellen führte zu einer vornehmlich nukleären Lokalisation von YB-1. Diese anti-hypertrophen Mechanismen sind spezifisch für eine PE-Induktion. Im Gegensatz zu der Hemmung der α-adrenerg induzierten Hypertrophie, konnte eine YB-1-Überexpression eine GDF-15 (3 ng / ml) stimulierte Hypertrophie nicht verhindern. Nach Stimulation mit GDF-15 kam es sowohl in nicht-infizierten adulten Kardiomyozyten, als auch nach Infektion mit AdGFP (1000 MOI) und auch mit AdYB-1 (1000 MOI) zu einer signifikanten Vergrößerung der Zellquerschnittsfläche sowie der relativen 14C-Proteinbiosynthese-Rate. Schlussfolgerung: H9c2-Zellen eignen sich als Modell für eine adenovirale Überexpression von YB-1 sowie für die Untersuchung von durch TGF-beta1 induzierten Apoptose-Prozessen. Es wurden mögliche YB-1-Signalwege zur Hemmung einer durch TGF-beta1 induzierten Apoptose sowie einer durch PE induzierten Hypertrophie aufgezeigt. YB-1 zeigt einen deutlichen protektiven Effekt in Kardiomyozyten.

As a result of an enduring pressure overload in the heart, there is a transition of adaptive hypertrophic growth to a development of heart failure. This process goes along with an increased TGF-beta1 expression as well as an induction of apoptosis. During these proceedings an activation of SMAD and AP-1 transcription factors is found in the heart. Those factors have an influence on hypertrophy and apoptosis events. The transcription factor YB-1 mediates inhibitory effects on genes associated with cell death and interacts with SMADs and AP-1. An adenoviral overexpression of YB-1 inhibits TGFbeta1-induced apoptosis and affects phenylephrine-induced hypertrophy. The aim of this study was to analyze the function of YB-1 in apoptosis and hypertrophy processes in cardiomyocytes. Moreover, H9c2-cells were to be established as a model for YB-1 overexpression and the analysis of TGF-beta signaling pathway.Infection of H9c2-cells with AdYB-1 (500 MOI) raised the relative YB-1-mRNA-expression after 24 h, and relative YB-1 protein expression increased after 24 h, 36 h and 48 h significantly. By means of immune fluorescence a preferential nuclear localization of YB-1 in H9c2-cells was proven. TGF-beta1 stimulation (1 ng / ml) led to phosphorylation of SMAD2 and SMAD3 and finally to apoptosis induction in H9c2-cells. A complex of P-SMAD2 and P-SMAD3 was detected after TGF-beta1 stimulation in H9c2-cells. Stimulation with TGF-beta1 led to a significant increase in expression of the TGF-beta target gene SMAD7.In adult cardiomyocytes TGF-beta1 stimulation in YB-1 overexpressing cells resulted in a significant decrease of SMAD4-, JunB and JunD-mRNA expression. SMAD7 was significantly higher expressed on mRNA- and protein level in adult cardiomyocytes after YB-1 overexpression. The alteration in SMAD and Jun expression seems to a possible mechanism for the anti-apoptotic effect of YB-1 in adult cardiomyocytes. The addition of TGF-beta1 to YB-1 overexpressing cells led to a significant increased cytoplasmic localization of YB-1 in H9c2-cells, whereas YB-1 overexpression alone showed a localization of YB-1 in the nucleus of H9c2-cells.After stimulation with the α-adrenoreceptor agonist phenylephrin (10 µM), there was a significant increase in cross sectional area as well as in relative 14C-proteinbiosynthesis rate in the control group and in the AdGFP (1000 MOI) infected group. After overexpression of YB-1 (1000 MOI) this hypertrophic stimulus was blocked. In YB-1 overexpressing cells and induction by PE significantly increased the relative mRNA expression of RGS2, which is an inhibitor of G-protein mediated signaling, in cardiomyocytes. In H9c2-cells YB-1 overexpression increased the RGS2-protein expression significantly after PE induction as well as YB-1 overexpression led to a significant increase of the anti-hypertrophic SMAD4-protein expression in cardiomyocytes and H9c2-cells and resulted in a significant increase of mRNA expression of JunD, which mediates antihypertrophic effects under PE in cardiomyocytes. There was a preferential nuclear YB-1 localization in YB-1 overexpressing H9c2-cells under PE-stimulation. The anti-hypetrophic effect is specific for PE stimulation since in contrast to PE, stimulation of hypertrophy by GDF-15 (3 ng / ml) was not blocked in YB-1 overexpression adult cardiomyocytes.Conclusion: H9c2-cells are suitable as a model for YB-1 overexpression as well as for investigations of TGF-beta1-induced apoptosis. Different signaling pathways of YB-1 were shown to influence TGF-beta1-induced apoptosis and PE-induced hypertrophy. YB-1 displays a strong protective effect in cardiomyocytes.
Keywords: ddc:630