Untersuchungen zur Pathogenese der Felinen Infektiösen Peritonitis mittels reverser Genetik - Spies, Danica; Justus Liebig University Giessen (My University, 2012)
Feline Coronaviren (FcoV) gelten als wichtige Forschungsobjekte, weil sie sowohl bei domestizierten als auch bei wildlebenden Feliden eine tödlich verlaufende Krankheit, die feline infektiöse Peritonitis (FIP) verursachen. Nach vorherrschender Meinung entsteht das verursachende Virus im Verlauf einer persistierenden Infektion mit einem relativ harmlosen felinen enteralen Coronavirus (FECV). Demnach führen Mutationen von FECV zur Entstehung des tödlichen FIP-Virus. Die Pathogenese der FIP ist allerdings weitgehend unbekannt. Für die Untersuchung der Pathogenese wurde ein revers-genetisches System für Serotyp II FcoV etabliert. Dafür wurde eine genomlange cDNA Kopie des FCoV Serotyp II Genoms in das Vaccinia Virus Genom integriert. Mittels Vaccinia Virus vermittelter homologer Rekombination wurden in mehreren Schritten einzelne Bereiche in einem bestehenden Serotyp I Konstrukt durch die korrespondierenden Serotyp II Sequenzen ausgetauscht. Der Vaccinia Virus-Vektor diente als Ausgangspunkt für die in vitro Synthese einer infektiösen genomischen RNA mit einer Größe von 30 Kilobasen. Hinsichtlich Wachstumskinetik und Plaquemorphologie bestand kein Unterschied zwischen dem rekombinanten Virus und dem Ausgangsvirus. Zudem führten beide Viren in einem Tierversuch zu FIP. Das FCoV-Genom aus den an FIP erkrankten Tieren wurde komplett sequenziert und die erhaltenen Sequenzen mit den Input-Virus-Sequenzen verglichen. Bei dem Vergleich wurden interessante Mutationen detektiert; ein Nukleotidaustausch fand in dem Gen S und ein weiterer im Gen 3c statt, der zur Wiederherstellung des ORF 3c führt. Mit Hilfe des revers-genetischen Systems wurden anschließend rekombinante FCoV hergestellt, die diese Mutationen einzeln und in Kombination aufwiesen. Für die Analyse der Treffzellen von FCoV wurde ein rekombinantes GFP-exprimierendes Serotyp II FCoV hergestellt, das anstatt der akzessorischen Gene 3abc das Reportergen GFP stabil exprimiert. Infektionsstudien mit felinen Blutzellen bestätigten Daten aus der Literatur, wonach lediglich Monozyten/Makrophagen als Treffzellen für FCoV dienen. Die Replikation in diesen Zellen sowie der Prozentsatz an infizierten Zellen nahmen zu, wenn die Infektion erst eine Woche nach Kultivierung der Blutzellen erfolgte. Um FCoV als Vektor für die Impfstoffherstellung einzusetzen, wurden rekombinante Serotyp I FCoV generiert, die calicivirale Strukturgene anstelle der Gene 3abc bzw. 7ab besaßen. An beiden Positionen im FCoV-Genom fand keine stabile heterologe Expression statt; große Teile der Fremdgene wurden deletiert. Die Stabilität des heterologen Gens wird beeinflusst vom coronaviralen Hintergrund, vom jeweiligen Fremdgen und von der Position im FCoV-Genom.
Keywords: Felines Coronavirus; FIP; revers-genetisches System; Monozyten; ddc:570