Dermaler Wirkstofftransport therapeutischer Oligonukleotide - Entwicklung und Charakterisierung nanopartikulärer Träger auf Basis von Chitosanpolymeren - Eicher, Anna Carola; Justus Liebig University Giessen (My University, 2021)
Die pharmakologische Therapie von Krankheiten schreitet durch den Einsatz biomolekülbasierter Wirkstoffe kontinuierlich voran. Alle Biomoleküle, wie Proteine, Peptide, DNA oder RNA teilen sich jedoch das grundsätzliche Problem der Empfindlichkeit gegenüber enzymatischem oder chemisch-physikalisch induziertem Abbau. Die Zielsetzung dieser Arbeit war die Entwicklung eines protektiven Wirkstofftransportsystems für kurze DNA-basierte Wirkstoffmoleküle, die DNAzyme. DNAzyme gehören zu den therapeutischen Oligonukleotiden und besitzen die Fähigkeit, Ziel-mRNA enzymatisch zu spalten. In dieser Arbeit wurde der Wirkstofftransport an den Zielort und der Einsatz von Polyplexen, bestehend aus DNAzym als Polyanion und polykationischen Polymeren, untersucht. Die Anwendbarkeit von natürlich vorkommenden Polyglucosaminen zur Polyplexbildung wurde aufgrund von deren Biokompatibilität und geringer Zytotoxizität untersucht. Für die dermale Applikation der Polyplexe wurden Hydrogele als äußere, polyplexumgebende Matrix entwickelt, ebenfalls basierend auf Chitosanpolymeren. In dieser Matrix wurden die sich spontan bildenden Polyplexe aus DNAzym und Chitosan eingebettet. Die in dieser Arbeit verwendeten Formulierungen wurden hinsichtlich ihrer Polyplex- (Partikel-) Größenverteilung, ihren physikochemischen Eigenschaften und ihrer Langzeitstabilität geprüft. In der zweiten Phase der Untersuchungen wurde die Leistungsfähigkeit des Wirkstofftransportsystems, hinsichtlich des Schutzes vor enzymatischem Abbau des DNAzyms durch hautassoziierte DNasen (Deoxyribonukleasen), untersucht. Basierend auf der Erkenntnis, dass hauptsächlich DNasen der Familie II am epidermalen Abbau des DNAzyms beteiligt sind, wurde ein neues in vitro Testsystem entwickelt. Es wurden Penetrationsversuche an Vollhautmodellen für die Hydrogele mit den integrierten Polyplexen durchgeführt und über die Quantifizierung des DNAzyms ausgewertet. Der Gehalt des penetrierten, intakten Oligonukleotides wurde über einen Hybridisierungs-ELISA ermittelt und zusätzlich über Konfokale-Laser-Scannning-Mikrokopie lokalisiert. Abgeschlossen wurde der experimentelle Teil durch Transfektionsexperimente auf Keratinozyten (HaCaT) mit fluoreszenzmarkiertem DNAzym. Die Untersuchungen konnten die effektive Kondensierung von DNAzym und Chitosan, in Abhängigkeit von deren Stoffmengenverhältnissen, zeigen. Die Stabilität des DNAzyms innerhalb des Wirkstofftransportsystems konnte für einen Zeitraum von 30 Tagen bei 25 °C mit einer Wiederfindung von 100 ± 15 % für alle Formulierungen gezeigt werden, sowie für einen Zeitraum von 60 Tagen bei 25 °C für fünf von acht Formulierungen. Über die Langzeitlagerungen der Chitosanhydrogele konnte eine Abnahme der Viskosität beobachtet werden, demnach müssen die Hydrogele weiter optimiert werden. Die mittlere Wiederfindung von 98,5 ± 4,0 % des Wirkstoffs aus dem DNase II-Assay weist stark darauf hin, dass DNAzyme, kompaktiert als Chitosanpolyplex, vor enzymatischem Abbau geschützt sind. Diese Erkenntnisse wurden durch die Ergebnisse des Penetrationsversuchs bestätigt. Im Vergleich zu wässrigen DNAzymlösungen konnte ein signifikant größerer Gehalt von intaktem DNAzym aus Schweinevollhaut nachgewiesen werden, nach der Behandlung mit polyplexbeladenen Hydrogelformulierungen. Zwischen dem Einsatz von chitosanbasierten Polyplexen und Trans-IT-Oligo-basierten Polyplexen konnte in Bezug auf die Transfektionseffizienz kein signifikanter Unterschied beobachtet werden. Auf Grundlage der hohen Schutzeffizienz für den Wirkstoff gegenüber enzymatischem Abbau bestätigt diese Arbeit abschließend die Anwendbarkeit von DNAzym/Chitosanpolyplexen für den dermalen Wirkstofftransport. Der Einsatz von chitosanbasierten Hydrogelmatrices ist aufgrund von säurevermittelten Polymerinstabilitäten hingegen als eingeschränkt zu bewerten. Zusammenfassend zeigen die durchgeführten Untersuchungen einen positiven Effekt für die Anwendung von Chitosan als Polyplexbildner für den Transport von DNAzymen ins stratum corneum.
Keywords: Antisense Oligonukleotide; Polyplex; Chitosan; dermale Applikation; DNase 2; DNAzym; 10-23 DNAzyme; ddc:540; ddc:570