Höfer, NicolaNicolaHöfer2023-06-122010-06-302023-06-122010http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:hebis:26-opus-76775https://jlupub.ub.uni-giessen.de/handle/jlupub/17637http://dx.doi.org/10.22029/jlupub-17015Der Mensch ist dem Schwermetall Cadmium über kontaminierte Lebensmittel, Trinkwasser oder Tabakrauch ausgesetzt. Grenzwertsetzungen sollen die orale Exposition gering halten und gegen die schon seit langem bekannte Toxizität von Cadmium schützen. Erst kürzlich hat die European Food Safety Agency aufgrund neuer Humandaten zur Nephrotoxizität die tolerierbare wöchentliche Aufnahme für Cadmium von 7 auf 2,5 µg/kg KG reduziert (EFSA 2009). Inzwischen wird Cadmium auch als potentieller endokriner Disruptor angesehen. Doch zum Wirkmechanismus, wie Cadmium hormonelle Effekte induzieren kann, ist noch nicht viel bekannt und estrogene Wirkungen sind im Tierversuch bislang nur nach intraperitonealer Injektion dokumentiert, also einem unphysiologischen Applikationspfad. Relevanter für die toxikologische Bewertung hormonartiger Wirkungen von Cadmium sind in vivo Studien mit oraler Verabreichung, denn die nichtrauchende Bevölkerung ist primär über die Nahrung exponiert.Die vorliegende Arbeit hat hormonartige Wirkungen von Cadmium in vitro an drei Zelllinien und in vivo am Modell der ovarektomierten (OVX) Ratte untersucht und charakterisiert. In vitro wurde die Aktivität von Cadmium anhand der Expression Estrogen-sensitiver Markergene in MCF-7 Brustkrebszellen und in den Darmkrebszelllinien HT-29 und HCT-116 untersucht. Für in vivo Studien wurden OVX Wistar-Ratten sowohl intraperitoneal (einmalig) als auch oral per gavage (an 3 Tagen) und via Trinkwasser (28 Tage) mit abgestuften Dosen Cadmiumchlorid behandelt. Hormonelle Wirkungen des Schwermetalls und eines Estrogens wurden mittels histologischer und molekularer Response-Parameter charakterisiert, und zwar nicht nur im klassischen Zielgewebe Uterus, das hauptsächlich Estrogenrezeptor-Subtyp alpha (ER alpha) exprimiert, sondern auch im Darm, der vor allem Rezeptor-Subtyp beta (ER beta) exprimiert und Nahrungsinhaltsstoffen und Kontaminanten ausgesetzt ist.Die in vitro Befunde zeigten, dass einige Tumorzelllinien für mechanistische Untersuchungen estrogener Effekte von Cadmium nur begrenzt geeignet sind, weil sie wichtige Rezeptoren im Zuge der Dedifferenzierung verlieren: Von den beiden Darmzellen zeigte nur eine Linie (HT-29) eine schwache Expression des ER alpha. Cadmium verstärkte konzentrationsabhängig die Expression von Metallothionein, das bekanntlich durch Metalle induziert wird. Allerdings konnte, anders als in vivo in der Mucosa, in den Darmzelllinien keine klar ausgeprägte Modulation Estrogen-regulierter Gene nachgewiesen werden. Die MCF-7 Zellen reagierten auf Behandlung mit Cadmium oder Estradiol mit einer verminderten ER alpha Expression; der Progesteron-Rezeptor wurde durch Estradiol oder die Kombination des Steroids mit dem Metall induziert, aber nicht von Cadmium allein. Möglicherweise intensiviert Cadmium die Bindung des Steroids an den Rezeptor und verstärkt so die estrogene Wirkung des natürlichen Liganden, während es allein eher antiestrogen wirkt.Die in vivo Befunde aus der Nagerstudie mit einem breiten Spektrum an Dosen und unterschiedlichen Expositionswegen sind publiziert (Höfer et al. 2009; Höfer et al. 2010). Dort dokumentierte Wirkungen am Uterus nach intraperitonealer (i.p.) Injektion von CdCl2 bestätigen im Prinzip frühere Befunde zur Estrogenität des Schwermetalls. Anhand der Expression von Complement Component 3 (C3) wurde aber deutlich, dass das Schwermetall in geringen Dosen offenbar auch antiestrogen wirken kann. Zum ersten Mal ist zudem nach oraler Exposition eine estrogenartige Wirkung für Cadmium gezeigt worden, die wie folgt charakterisiert ist: Nach Kurz- und Langzeit-Verabreichung von CdCl2 sind morphologische Parameter der Estrogenität am Uterus unbeeinflusst, während das Estrogen-regulierte C3-Gen deutlich induziert ist. Der Expositionspfad und die Dosis spielen also eine entscheidende Rolle für die Ausprägung hormoneller Wirkungen am Zielorgan Uterus: Die deutlich höhere estrogene Potenz von Cadmium nach i.p. Injektion geht einher mit >100-fach höheren Cd-Gewebespiegeln als nach oraler Verabreichung der gleichen Dosis (Höfer et al. 2009).Weitere Ergebnisse zeigen erstmals, dass Cadmium auch im Darm der Ratten typische Estrogen-responsive Parameter moduliert: Nach subchronischer Exposition ist die Expression von ER beta und pS2 vermindert, die des Vitamin-D-Rezeptors (VDR) Gens aber nicht signifikant moduliert. Während im VDR Gen kein Estrogen-responsives Element (ERE) vorhanden ist, verfügen das pS2 und das ER beta Gen über EREs im Promotor. Die Befunde sprechen also für eine Cadmium-abhängige Regulierung von Zielgenen über die EREs (Höfer et al. 2010). Ungeklärt ist allerdings die Rolle anderer Signalwege. Die hier in der Rattenmucosa aufgedeckte verminderte Expression des ER beta nach Schwermetallexposition ist von weitergehendem Interesse, weil dieser Rezeptor offenbar eine wichtige Rolle in der Darmhomöostase spielt. Daher und zur Aufklärung des Wirkmechanismus von Cadmium sind weitere Studien angezeigt.Human exposure to the heavy metal cadmium (Cd) occurs with contaminated food, drinking water and tobacco smoke. Setting of limit values are means to reduce oral exposure and thus protect consumers against the well known toxicity of cadmium. Recently, the European Food Safety Agency has lowered the tolerable weekly intake from 7.5 to 2.5 µg per kg body weight, based on new data for nephrotoxicity of cadmium in humans (EFSA 2009). Cadmium is now also regarded as metalloestrogen and potential endocrine disruptor. However, little is known about the mechanisms by which it elicits hormonal effects in cells, and estrogenic activity in vivo has only been documented so far in rodents upon intraperitoneal injection, an unphysiological exposure route. But, more relevant for a toxicological evaluation of hormonal effects are rodent studies with oral administration, since cadmium exposure in nonsmokers is mainly from dietary intake.The experimental work of this thesis comprises investigations on hormonal effects of cadmium in vitro, in three cell lines, and studies in a rat model, the ovariectomized Wistar rat. Cadmium activity in vitro was studied by means of estrogen-sensitive marker genes in MCF-7 breast cancer cells and in the colon cancer cell lines HT-29 und HCT-116. For in vivo studies, rats received different doses of cadmium chloride (CdCl2), either by i.p. injection (once), by gavage (on 3 days) or with drinking water (28 days). Hormonal effects resulting from heavy metal and reference steroid estrogen exposure were characterized by analysis of established histological and molecular response parameters, first in the uterus, a target tissue that expresses primarily the estrogen receptor subtype alpha (ER alpha), but also in the intestinal tract since the gut is directly exposed to food contaminants and expresses mostly the estrogen receptor subtype beta (ER beta). The results obtained in vitro indicate that some tumour cell lines are of limited value for mechanistic studies of estrogenicity of cadmium since important receptors are lost in dedifferentiation: Of the two colon tumour cell lines only one (HT-29) showed a weak expression of ER alpha. Cadmium increased concentration-dependently the expression of metallothionein that is known to be induced by metals. But, other than observed in vivo in rat mucosa (vide infra), colon cell lines showed no clear modulation of estrogen-regulated genes. The MCF-7 breast cancer cells responded to treatment with cadmium or estradiol by down-regulation of ER alpha expression; the progesterone receptor was induced by estradiol or a combination of steroid and metal, but not by cadmium alone which decreased PR expression. Cadmium may enhance binding of the steroid to its receptor and thereby increase estrogenic effects of the natural ligand, whilst cadmium alone appears to act antiestrogenic.The results of the in vivo studies for a wide range of doses and different exposure routes have been published recently (Höfer et al. 2009; Höfer et al. 2010). Effects on the rat uterus seen upon intraperitoneal (i.p.) injection of CdCl2 confirm in principal earlier findings on an estrogenic activity of the heavy metal. Yet, decreases in uterine complement component 3 (C3) expression at some lower doses indicated also antiestrogenic effects of the heavy metal. Furthermore, there is now evidence for estrogenic activity upon oral exposure to cadmium that is characterized as follows: Upon short- and long-term administration of CdCl2, the morphological parameters of estrogenicity remain unaffected in uterus, whilst the estrogen-regulated C3 gene is clearly induced. Route of exposure and dose are major determinants of potency at the target organ uterus, and a much higher estrogenic activity of cadmium upon i.p. injection is in line with >100-fold higher Cd-tissue levels than after oral administration of a comparable dose (Höfer et al. 2009).Moreover, new findings indicate that cadmium can also modulate some estrogen-responsive parameters in the intestinal tract of rats: After subchronic oral metal exposure the expression of ER beta and pS2 was clearly decreased, that of vitamin D receptor (VDR) was not significantly affected. The ER beta and pS2 genes possess an estrogen responsive element (ERE) in their promoter, whilst EREs are not present in the promoter of the VDR gene. The results thus support the notion of cadmium regulating target genes via EREs, although other signalling events cannot be excluded at present (Höfer et al. 2010). The pronounced down-regulation of ER beta and pS2 in rat intestine seen after heavy metal exposure are of concern, since pS2 is involved in mucosal healing and ER beta in inflammatory bowel disease. Therefore, further investigations on the mode of action of cadmium are indicated.de-DEIn CopyrightCadmiumendokrine DisruptionExpositionsrouteUterusDünndarmcadmiumendocrine disruptionroute of exposureuterussmall intestineddc:500