Identification and first characterization of pairing-dependently transcribed genes in Schistosoma mansoni males - Leutner, Silke; Justus Liebig University Giessen (My University, 2013)
Schistosoma mansoni males have a key role in the unique reproduction biology of these parasitic flatworms. Without a constant pairing contact to the male the female is unable to complete or maintain its sexual maturation, which is the prerequisite for egg production. The eggs themselves are the causative agent of a disease with world-wide importance: schistosomiasis. Little is known about the process by which males affect female development. Different types of molecules have been suggested as stimulus but none was identified so far. It was also hypothesized that males are influenced by pairing as well, obtaining a status of competence which enables them to induce female sexual maturation. Again, only scarce information is available on such processes in males. EST and genome projects for schistosomes have opened new possibilities to study these male mechanisms also on the transcriptome level. The here described study was performed to identify differences between pairing-experienced (EM) and pairing-unexperienced (UM) males.Preliminary experiments had indicated a stimulatory effect of pairing and tumor necrosis factor alpha (TNFalpha) on the mitotic activity (MA) in males. Furthermore, evidence was provided for the differential expression of a S. mansoni cGMP-dependent protein kinase (SmcGK1) between EM and UM. While the effect of pairing on the MA of males was not confirmed by results obtained in this thesis, a concentration and medium-dependent stimulation of MA in males as response to TNF& #945; was observed. SmcGK1 was not found to be differentially transcribed between EM and UM. However, localization studies detected SmcGK1 transcripts in the reproductive organs of male and female worms, and inhibitor studies indicated an influence of SmcGK1 on worm motility and egg production.To unravel differences between EM and UM on a larger scale, the transcriptomes of these two male stages were compared combining two different methods, microarrays and SuperSAGE. As expected, both methods confirmed and complement each other. Additional confirmation of the results was obtained by real-time PCR experiments. Usage of bioinformatic tools such as gene ontology analysis, Ingenuity Pathway Analysis and schistosome-specific metabolome analysis facilitated data interpretation. Different statistical analyses were used and their influence on the data was emphasized.Microarray analyses and SuperSAGE detected 9,344 and 7,494 sense transcripts, respectively. Merging both data-sets it was found that 6,326 transcripts were detected by both analyses, of which 29 were significantly differentially (q < 0.01; p < 1-10; log2ratios > 0.585 or < -0.585) transcribed between EM and UM. To date, this is the most comprehensive data-set on differential transcription in male S. mansoni. The data indicated differences in metabolic processes between EM and UM, confirming previous hypotheses. Beyond that evidence was obtained for the contribution of neuronal signaling, anti-sense regulation and schistosome-specific protein coding genes, in the male-female interaction. Genes protruding from the analyses were among others, a dopa-decarboxylase, the signaling molecules dock and pinch, and the TGFbeta-pathway inhibitor follistatin (SmFst). First characterization studies provided evidence for SmFst transcription in the reproductive organs of EM, UM and females. Furthermore, the interaction of SmFst with an inhibin/activin-like protein (SmInAct) and a bone morphogenic protein (SmBMP) of S. mansoni was shown by yeast-two-hybrid experiments. Localization studies demonstrated that all three transcripts localize in the testes of EM and UM. These findings indicate a yet unknown function of the TGFbeta-pathway in male schistosomes and a possible influence of pairing on the male gonad.

Schistosoma mansoni Männchen haben eine Schlüsselrolle in der einzigartigen Reproduktionsbiologie dieser parasitären Plattwürmer. Ohne einen konstanten Paarungskontakt mit dem Männchen kann das Weibchen seine geschlechtliche Reife weder erlangen noch erhalten. Diese ist jedoch die Grundlage für die Produktion der Eier, welche die Auslöser der weltweit bedeutenden Krankheit Schistosomiasis sind.Über die Prozesse, durch die Männchen auf die Entwicklung der Weibchen wirken, ist wenig bekannt. Verschiedene Arten von Molekülen wurden als Stimulanzien vorgeschlagen, doch wurde bisher keines verifziert. Weiterhin gibt es die Hypothese, dass auch Männchen durch die Paarung beeinflusst werden, wobei sie einen Kompetenz-Status erreichen, der es ihnen ermöglicht, die Reifung des Weibchens zu stimulieren. Auch hierfür gibt es derzeit nur wenige Daten. Die EST- und Genomprojekte für Schistosomen haben neue Möglichkeiten eröffnet, die Prozesse in Männchen auch durch Transkriptomanalysen zu untersuchen. Die hier beschriebene Studie wurde durchgeführt, um Unterschiede zwischen paarungserfahrenen (EM) und paarungsunerfahrenen (UM) Männchen aufzudecken. Vorhergehende Experimente hatten angedeutet, dass sowohl die Paarung als auch TNFalpha einen Einfluss auf die mitotische Aktivität (MA) in Männchen hatten. Weiterhin gab es Hinweise darauf, dass eine S. mansoni cGMP-abhängige Protein-Kinase (SmcGK1) differentiell zwischen EM und UM transkribiert wurde. Während ein Einfluss der Paarung auf die MA in Männchen in der vorliegenden Studie nicht bestätigt werden konnte, wurde ein Konzentrations- und Medium-abhängiger Effekt von TNFalpha auf die MA von Männchen gefunden. Differentielle Transkription von SmcGK1 zwischen EM und UM wurde nicht nachgewiesen. Allerdings zeigten Lokalisationsstudien, dass SmcGK1-Transkripte in den Reproduktionsorganen weiblicher und männlicher S. mansoni vorliegen. Weiterhin gaben Inhibitorstudien Hinweise darauf, dass SmcGK1 einen Einfluss auf die Beweglichkeit und die Eiproduktion der Würmer hat.Um Unterschiede zwischen EM und UM in größerem Maß aufzudecken, wurden zwei unterschiedliche Methoden zur Transkriptomanalyse, Microarrays und SuperSAGE, kombiniert. Wie erwartet bestätigten und ergänzten sich beide Methoden gegenseitig. Zusätzliche Bestätigung der erhaltenen Ergebnisse wurde durch real-time PCR-Experimente erzielt. Die Verwendung bioinformatischer Programme wie gene ontology Ingenuity Pathway Analysis , sowie einer S. mansoni-spezifische Metablomanalyse vereinfachte zusätzlich die Dateninterpretation. Unterschiedliche statistische Verfahren wurden angewendet und ihr Einfluss auf die Daten hervorgehoben.Mittels Microarray-Analysen und SuperSAGE wurden insgesamt je 9,344 und 7,394 sense-Transkripte detektiert. Der Vergleich beider Datensätze ergab, dass 6,326 Transkripte mit beiden Methoden nachgewiesen wurden, wobei 29 dieser Gene signifikant und differenziell (q < 0.01; p < 1-10; log2ratios > 0.585 oder < -0.585) zwischen EM und UM transkribiert waren. Zu diesem Zeitpunkt ist dies der umfassendste Datensatz bezüglich differentieller Transkription in S. mansoni Männchen. Die Daten beinhalteten Hinweise auf Unterschiede zwischen EM und UM in metabolischen Prozessen, ein Befund, der frühere Studien bestätigt. Zusätzlich wurden Hinweise auf die Beteiligung neuronale Signaltransduktion, anti-sense Regulation und Schistosomen-spezifischer, Protein-kodierender Gene gefunden, die an der Männchen-Weibchen-Interaktion beteiligt sein könnten. Verschiedene Gene wurden durch die Datenanalyse hervorgehoben, darunter sind eine Dopa-Decarboxylase, die Signalmoleküle Dock und Pinch und der TGFbeta-Signalweg-Inhibitor Follistatin (SmFst). Anhand erster Charakterisierungsstudien wurden Transkripte für SmFst in den Reproduktionsorganen von EM, UM und Weibchen gefunden. Weiterhin konnte die Interaktion von SmFst mit einem Inhibin/Activin-ähnlichen Protein (SmInAct), sowie einem bone morphogenic protein (SmBMP) aus S. mansoni mittels yeast-two-hybrid -Analysen nachgewiesen werden. Transkripte aller drei Gene wurden in den Testes von EM und UM lokalisiert. Diese Ergebnisse legen eine bisher unbekannte Funktion des TGFbeta-Signalweges in Schistosomenmännchen nahe, sowie eine mögliche Beeinflussung der männlichen Gonaden durch die Paarung.
Identifizierung und erste Charakterisierung von paarungs-abhängig transkribierten Genen in Schistosoma mansoni-Männchen
Keywords: Schistosoma; Männchen; Microarray; SuperSAGE; Follistatin; Schistosoma; male . microarray; SuperSAGE; follistatin; ddc:570