Untersuchungen zur Rolle des larvalen hämatopoetischen Organs von Manduca sexta bei der Hämatopoese und der Immunantwort - Bredow, Christoph-Rüdiger Hubertus Harald Alexander von; Justus Liebig University Giessen (My University, 2017)
Insekten besitzen ein Immunsystem, welches auf humoralen und zellulären Aktivitäten fußt und als angeborenes Immunsystem der Insekten bezeichnet wird (Reviews: BOMAN et al., 1991; HULTMARK, 1993; HOFFMANN, 1995; GILLESPIE et al., 1997). Ihnen fehlt das adaptive Immunsystem der Vertebraten, welches auf Antikörperbildung, T-Zell-vermittelten Immunreaktionen oder klonaler Proliferation von B-Zellen basiert (Review: COOPER und ALDER, 2006). Die für die zelluläre Immunantwort der Insekten zuständigen Zellen sind v. a. im Hämocoel zirkulierende sogenannte Hämozyten, die Fremdkörper erkennen und bekämpfen können (Review: STRAND, 2008). Der Ursprung der Hämozyten in Lepidoptera wurde bislang mit Hilfe morphologischer Kriterien und weniger Marker untersucht. Es sind bei Manduca sexta-Larven hämatopoetische Organe bekannt, die mit den Flügelanlagen assoziiert sind. Zu diesen hämatopoetischen Organen existieren zurzeit zwei Publikationen, die die Bildung und Verteilung von Plasmatozyten in bzw. durch diese beschreiben (NARDI et al., 2003; BEETZ et al., 2004). Untersuchungen innerhalb der AG TRENCZEK legen nahe, dass noch weit differenziertere Aussagen über die Verteilung und Entwicklung der Hämozyten in diesen Organen möglich sind (WÜNSCH, 2008; C.-R. VON BREDOW, 2010; KOZISSNIK, 2011).Für die Analyse der durch das hämatopoetische Organ gebildeten Hämozyten wurde ein Werkzeugkasten, bestehend aus Antikörpern, Lektinen, RNA-Sonden gegen bekannte sowie bislang in M. sexta unbeschriebene Gene und Enzymaktivitätstests erstellt, um mit diesem das hämatopoetische Organ zu charakterisieren. Der Vergleich mit zirkulierenden Hämozyten bestätigte, dass im hämatopoetischen Organ, neben nicht markierbaren Hämozyten, nur Plasmatozyten enthalten sind. Es konnte eine Zonierung gezeigt werden, die auf eine lokale Konzentration von Zellen in unterschiedlichen Differenzierungszuständen hinweist. Sowohl in Zirkulation als auch im hämatopoetischen Organ konnten Hämozyten nachgewiesen werden, die sich durch eine Markierung der Zellmembran mit dem Lektin aus Arachis hypogaea (PNA) nachweisen lassen und eine hohes Zellkern-zu-Zytoplasma-Verhältnis aufweisen. Letzteres wird als Merkmal für Prohämozyten angesehen (BEAULATON und MONPEYSSIN, 1976; MONPEYSSIN und BEAULATON, 1978; GUPTA, 1979). Im hämatopoetischen Organ liegen diese Zellen in einer Zone nahe der von Öffnungen durchbrochenen Basallamina, die ein Auswandern von Hämozyten ermöglichen. Doppelmarkierungen mit PNA und verschiedenen gegen Hämozyten gerichteten Antikörpern zeigten, dass durch PNA an der Zellmembran markierbare Hämozyten Merkmale aller Hämozytentypen besitzen können.In Hämozyten und hämatopoetischen Organen von M. sexta konnten erstmals die mRNA für zwei Phagozytoserezeptoren (Eater-ähnliches Protein und Croquemort-ähnliches Protein), für eine Pre-nyltransferase (Heixuedian-ähnliches Protein) und für ein Peroxidasin-ähnliches Protein identifiziert werden. Die für das Eater-ähnliche Protein kodierende mRNA konnte nur in Zellen des hämato-poetischen Organs, die dem Hämocoel zugewandt sind, sowie Plasmatozyten in Zirkulation nachgewiesen werden.Des Weiteren wurde eine gesteigerte mRNA-Synthese ausgewählter immunrelevanter Gene in Antwort auf Infektionen in Hämozyten, im hämatopoetischen Organ, im Fettkörper und im Mitteldarm mit Hilfe von real-time qPCR nachgewiesen. Dadurch konnte gezeigt werden, dass eine Darminfektion eine Reaktion im Darmgewebe und, ohne dass Bakterien in das Hämocoel eingedrungen sind, auch im Fettkörper, in den Hämozyten und im hämatopoetischen Organ auslöst. Bei einer systemischen Infektion reagierten ebenfalls der Fettkörper, die Hämozyten und das hämatopoetische Organ mit veränderter mRNA-Synthese dieser Gene, jedoch nicht der Mitteldarm. Das hämatopoetische Organ reagierte mit erhöhter mRNA-Synthese von PGRP-1A auf die Darminfektion und erhöhter mRNA-Synthese von PGRP-1A, Lysozym und Scolexin A auf die systemische Infektion.Die für Lysozym kodierende mRNA sowie das Protein selbst konnten in Zellen des hämatopoetischen Organs außerdem durch RNA-in-situ-Hybridisierung bzw. Antikörpermarkierungen nachgewiesen werden. Dies sind die ersten Hinweise für eine direkte Beteiligung des hämatopoetischen Organs am Immungeschehen in M. sexta.

Immunity in insects relies on humoral factors and cell mediated responses, which are the two parts of the innate immune system. Antibodies, T-cell-mediated reactions or clonal selection as it is known for the adaptive immune system of vertebrates are absent in insects (reviewed in: BOMAN et al., 1991; HULTMARK, 1993; HOFFMANN, 1995; GILLESPIE et al., 1997). The cellular immune response is mediated by circulating haemocytes (reviewed in STRAND, 2008). Haemocytes are able to phagocytise and encapsulate foreign bodies. In Manduca sexta larvae, haematopoietic organs associated with the wing discs are known to be a source for plasmatocytes and putative prohaemocytes. This was demonstrated by antibody labelling with three hemocyte specific antibodies (NARDI et al., 2003, BEETZ et al., 2004).To better understand the function of the haematopoietic organ, a set of tools comprising antibodies specific for one or more haemocyte types, lectins, and enzyme based assays was used. Cells of the haematopoietic organs and cells released by these organs in vitro were compared with circulating haemocytes. Only plasmatocyte markers and the lectin PNA labelled cells in distinct regions of the haematopoietic organ. These results lead to the conclusion that the only differentiating haemocyte type in the haematopoietic organs is the plasmatocyte. Granular cells, oenocytoids, and spherule cells were absent in the haematopoietic organ as well as in in-vitro-cultured haemocytes derived from the haematopoietic organ. Different plasmatocyte markers labelled cells in different, but over-lapping regions of the haematopoietic organ with prevalence to the distal part of the haematopoietic organ, i.e. near openings of the basal matrix where the cells are in close contact to the haemolymph. These regions may represent areas of gradual cell differentiation within the tissue, leading to plasmatocytes ready to leave the organ. Peanut agglutinin (PNA) labels the cell membrane of a haemocyte type with similarities to prohaemocytes. However, haematopoietic organ cells positive for PNA and free floating haemocytes positive for PNA at the cell membrane (PNAm+) exhibit a high nucleus-to-cytoplasm ratio which is recognized as a characteristic of prohaemocytes (BEAULATON and MONPEYSSIN, 1976; MONPEYSSIN and BEAULATON, 1978; GUPTA, 1979). By double labelling, some PNAm+-haemocytes were shown to possess epitopes specific for other haemocyte types as well. Therefore, it is likely that PNA membrane labelling marks haemocytes of a distinct, less differentiated state. Since PNAm+-haemocytes were found in the haematopoietic organ, a connection of the haematopoietic organ derived putative prohaemocytes to the circulating differentiated haemocytes is highly likely.Transcripts of two phagocytosis receptors (eater-like and croquemort-like), an extracellular matrix associated protein (peroxidasin-like) and a prenyl transferase involved in normal haematopoiesis in D. melanogaster (heixuedian-like) were identified in M. sexta. Eater-like-mRNA was detected in free plasmatocytes and the distal region of the haematopoietic organ. The expression of phagocytosis receptors marks functionally differentiated haemocytes. Therefore, the expression of eater-like-mRNA in the distal region of the haematopoietic organ is another indication for plasmatocyte maturation in distinct regions of the haematopoietic organ.The reaction of the haematopoietic organ, the haemocytes, the fat body and the midgut in response to either gut borne infection or systemic infection was determined based on the mRNA-levels of four different immunity-related genes by real-time quantitative PCR. In response to gut mediated infection, the midgut as well as the haemocytes, the haematopoietic organ and the fat body increased the synthesis of the mRNA of at least one gene observed. In response to a systemic infection, the midgut did not react at all, whereas the other tissues observed .For the haematopoietic organ, an increased level of PGRP-1A-mRNA in response to the gut infection and an increased level of lysozyme- and scolexin A-1A-mRNA in response to the systemic bacterial infection were measured. Furthermore, lysozyme-mRNA and lysozyme-protein were detected in the haematopoietic organ by means of RNA-in-situ- hybridization and immune histology. Together, these are the first evidences of a direct involvement of the haematopoietic organ in immune responses in M. sexta.
Studies of the role of the larval haematopoietic organ of Manduca sexta in haematopoiesis and immune response
Keywords: Insektenhämatopoese; hämatopoetisches Organ; Hämozyten; Insektenimmunologie; Manduca sexta; insect hematopoiesis; hematopoietic organ; hemocytes; insect immunity; Manduca sexta; ddc:570