Pulmonale Hypertonie : Einfluss von Paxillin auf die Regulation der pulmonalarteriellen glatten Muskelzellen - Veith, Christine; Justus Liebig University Giessen (My University, 2012)
Die pulmonale Hypertonie ist eine schwerwiegende Erkrankung, die durch einen pulmonalen Gefäßumbauprozess charakterisiert ist. Charakteristika des Umbauprozesses sind eine erhöhte Migration und Proliferation von pulmonalarteriellen glatten Muskelzellen (PASMC), eine vermehrte Deposition von Proteinen der extrazellulären Matrix, sowie eine Dysregulation von zytoskeletalen Proteinen. Die Rolle von zytoskeletalen Proteinen an der pulmonalen Hypertonie ist bisher nur unzureichend verstanden und untersucht worden. Im Rahmen dieser Arbeit wurde nach neuen Interaktionspartnern des zytoskeletalen Adapter-Proteins Fhl-1 gesucht, welches erst kürzlich als mögliches, neues Schlüsselprotein für die Entwicklung der pulmonalen Hypertonie identifiziert werden konnte. Schließlich galt es, die Beteiligung des neuen Fhl-1 Interaktionspartners am vaskulären Gefäßumbauprozess und die ihm zugrunde liegenden funktionellen Prozesse zu untersuchen. Mittels Yeast two-Hybrid Untersuchungen konnte in Kooperation mit Dualsystems Biotech AG (Schweiz) Paxillin als neues Fhl-1 bindendes Kandidaten-Protein identifiziert werden. Die native Protein-Protein Bindung konnte durch Ko-Immunopräzipitations-Versuche in PASMC der Maus und des Menschen bestätigt werden. Beide Proteine zeigten zudem eine Ko-Lokalisation in PASMC, sowohl in vitro als auch in vivo. In Lungenproben von Patienten mit idiopathischer pulmonalarterieller Hypertonie (IPAH) konnte eine erhöhte Expression von Paxillin detektiert werden, sowohl auf mRNA als auch auf Protein-Ebene. In lasermikrodissezierten intrapulmonalen Arterien der Maus trat zudem eine vermehrte Paxillin-Expression in der Hypoxie-induzierten pulmonalen Hypertonie auf. In PASMC isoliert aus dem Monocrotalin-Modell der pulmonalen Hypertonie ergab sich die Tendenz einer gesteigerten Paxillin-Expression. Auf Zellebene wurde der Einfluss von Paxillin auf die Zell-Physiologie deutlich. Das Paxillin silencing inhibierte Adhäsions- und Proliferations-Vorgänge und erhöhte das Apoptose-Verhalten von humanen PASMC; reguliert werden diese Prozesse möglicherweise über die Kinasen Akt und Erk1/2. Neben der erhöhten Paxillin-Expression in IPAH konnte in den Lungen diesen Patienten auch eine gesteigerte Expression des extrazellulären Matrixproteins Fibronektin nachgewiesen werden. Fibronektin begünstigte das Adhäsions-Verhalten von humanen PASMC, welches wiederum in Folge des Paxillin silencings inhibiert wurde. Neben dem Einfluss auf das Adhäsions-Verhalten von PASMC induzierte Fibronektin eine erhöhte Paxillin Tyrosin 118 Phosphorylierung. Schließlich konnte die Hypoxie als neuer Stimulus für die Paxillin-Expression in humanen PASMC identifiziert werden. Die Inkubation der Zellen unter hypoxischen Bedingungen (1 % O2) bewirkte eine Zunahme sowohl der Paxillin-Expression als auch der Paxillin Tyrosin 31 und 118 Phosphorylierung. HIF-1α silencing Experimente verdeutlichten, dass die Hypoxie-abhängige Expression von Paxillin durch HIF reguliert wird. Zusammenfassend konnte Paxillin als neuer Fhl-1 Interaktionspartner identifiziert werden. Neben Fhl-1 kann auch Paxillin eine funktionelle Rolle in der Physiologie/Pathophysiologie der PASMC zugeordnet werden. Paxillin kann demnach als ein möglicher, neu identifizierter Auslöser für pulmonalvaskuläre Gefäßumbauprozesse angesehen werden.

Pulmonary hypertension is a fatal disease characterised by increased pulmonary vascular remodelling processes such as increased migration and proliferation of pulmonary arterial smooth muscle cells (PASMC), enhanced matrix deposition and deregulation of cytoskeletal proteins. However, the contribution of cytoskeletal proteins in pulmonary hypertension is still not fully understood and investigated. Therefore, a screening for new interacting partners of the cytoskeletal adaptor protein Fhl-1, which was recently identified as a possible key molecule for pulmonary hypertension development was performed, and their possible contribution to the vascular remodelling processes was assayed. Using a yeast two-hybrid analysis in cooperation with Dualsystems Biotech AG (Switzerland) identified paxillin as a novel candidate for an interaction partner of Fhl-1. Native protein-protein binding was confirmed by co-immunoprecipitation studies in mouse and human PASMC. Both proteins co-localised in PASMC in vitro and in vivo. In lung samples from idiopathic pulmonary arterial hypertension (IPAH) patients paxillin expression was increased on mRNA and protein levels. Laser-microdissection of murine intrapulmonary arteries revealed elevated paxillin expression in hypoxia-induced pulmonary hypertension. PASMC isolated from the monocrotaline model of pulmonary hypertension revealed a tendency towards a not significant increase in paxillin expression. On single cell level silencing of paxillin expression led to decreased PASMC adhesion, proliferation, and increased apoptosis. Regulation of these processes occurred via Akt and Erk1/2 kinases. Next to the enhanced paxillin expression in IPAH elevated expression of the extracellular matrix protein fibronectin was observed in lungs of these patients. Fibronectin promoted adhesion of human PASMC, which was shown to be critically dependent on paxillin expression. Next to its role in cell adhesion fibronectin stimulated paxillin tyrosine 118 phosphorylation. Finally, hypoxia was identified as an additional stimulus of paxillin expression. Exposure of human PASMC under hypoxic conditions (1% O2) caused a pronounced increase in paxillin expression as well as tyrosine 31 and 118 phosphorylation. HIF-1α silencing experiments revealed that the hypoxia-induced increase in paxillin expression was HIF-dependent. Taken together, paxillin was identified as a novel Fhl-1 binding partner and demonstrated a functional role of paxillin in PASMC physiology/pathophysiology which might be a novel trigger for pulmonary vascular remodelling processes.
Pulmonay hypertension : influence of Paxillin on pulmonary arterial smooth muscle cell regulation
Keywords: Lunge; Pulmonale Hypertonie; Gefäßumbauprozess; Zytoskelett; lung; pulmonary hypertension; remodelling; zytoskeleton; ddc:500