Hypercapnia decreases Na,K-ATPase plasma membrane abundance by impairing endoplasmic reticulum maturation of its beta-subunit in alveolar epithelial cells - Kryvenko, Vitalii; Justus Liebig University Giessen (My University, 2020)
The main hallmarks of acute respiratory distress syndrome (ARDS) are impaired gas exchange and alveolar edema, which are often associated with elevated levels of CO2 (hypercapnia) due to the disruption of the alveolar-capillary barrier and in part as a consequence of lung-protective mechanical ventilation by using low tidal volumes. Both decreased alveolar fluid clearance (AFC) and hypercapnia have been shown to be associated with worse outcomes in patients with ARDS. The resolution of alveolar edema directly correlates with AFC, which is driven by a vectorial Na+ transport, mediated by the coordinated action of the apically-localized epithelial Na+ channel (ENaC) on the apical and the Na,K-ATPase (NKA) on the basolateral side. The endoplasmic reticulum (ER) is the main organelle that is involved in the proper maturation of glycoproteins. NKA is a heterodimeric glycoprotein that in order to be delivered to the plasma membrane must be assembled in the ER. A disturbance in the ER maturation may result in a decreased plasma membrane abundance of the transporter and an impaired alveolar fluid clearance.Here, we provide evidence that hypercapnia (pCO2=120 mmHg; pHe=7.4) decreases the NKA plasma membrane abundance by affecting the ER folding of the beta-subunit of the enzyme in alveolar epithelial cells. We found that the short-term exposure of cells to elevated CO2 levels (up to 1 hour) results in depletion of the ER Ca2+ stores by a leakage through 1,4,5-triphosphate receptors (IP3R). The rapid activation of serine/threonine-protein kinase/endoribonuclease inositol-requiring enzyme 1alpha (IRE1alpha) triggers ER-associated degradation (ERAD) of the NKA beta-subunit, which subsequently decreases the cell surface expression of the transporter. The inhibition of Ca2+ release through IP3R receptors stabilizes the levels of the ER-resident NKA-beta and increases the plasma membrane abundance of the enzyme. In contrast, long-term hypercapnia (up to 72 hours) promotes significant retention of the NKA beta-subunit in the ER. This is followed by increased protein oxidation in the ER and the disruption of the Na,K-ATPase alpha/beta-complex formation. Furthermore, disturbances in ER homeostasis activate the adaptive unfolded protein response (UPR) by increasing the phosphorylation of eukaryotic initiation factor 2alpha (eIF2alpha) by protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase (PERK). Moreover, we demonstrate that administration of alpha-ketoglutaric acid to hypercapnia-exposed cells prevents ER protein oxidation and restores plasma membrane abundance of the Na,K-ATPase.Taken together, short- and long-term exposure to elevated CO2 levels result in misfolding of the Na,K-ATPase beta-subunit in the ER and decrease the plasma membrane expression of the Na,K-ATPase alpha/beta-complex, which impairs alveolar fluid clearance. Understanding the mechanisms of hypercapnic respiratory failure may provide new approaches in the treatment of patients with ARDS.

Die Hauptmerkmale des akuten Atemnotsyndroms (ARDS) umfassen ein Lungenödem und einen gestörten Gasaustausch, die häufig mit einem erhöhten CO2-Gehalt (Hyperkapnie), aufgrund einer Störung der alveolo-kapillären Barriere, und einer lungenschützenden mechanischen Beatmung, mithilfe eines niedrigen Tidalvolumen, verbunden sind. Es zeigte sich, dass das Zusammenspiel von Hyperkapnie und einer verminderten Clearance der Alveolarflüssigkeit (AFC) zu einem schlechteren Krankheitsverlauf bei ARDS-Patienten führt. Das Ausschwämmen des Lungenödems korreliert direkt mit der AFC, welche durch einen zielgerichteten vektoriellen Na+-Transport, einerseits durch den apikal lokalisierten epithelialen Na+-Kanals (ENaC) und anderseits durch die basolateral lokalisierten Na,K-ATPase (NKA) bestimmt wird. Das endoplasmatische Retikulum (ER) ist die Hauptorganelle, die an der ordnungsgemäßen Reifung von Glykoproteinen beteiligt ist. NKA ist ein heterodimeres Glykoprotein, dessen Untereinheiten im ER aufgebaut und danach von der Plasmamembran freigegeben wird. Eine Störung im Reifungsprozess des ER kann zu einer verringerten Transporterfreisetzung führen, was eine beeinträchtigte Alveolarflüssigkeitsclearance nach sich ziehen könnte.Unsere vorliegenden Daten belegen, dass die Hyperkapnie (pCO2=120 mmHg; pHe=7.4) den Zusammenbau einer Enzym-beta-Untereinheit im ER von Alveolarepithelzellen beeinflusst, was die NKA-Freisetzung an den Plasmamembranen verringert. Es zeigte sich, dass die kurzfristige Erhöhung des CO2-Spiegels (bis zu 1 Stunde) zu einer Erschöpfung des Ca2+-Speichers führte, was wiederum in einem Verlust der IP3R-Rezeptoren und der raschen Aktivierung von IRE1alpha im ER resultierte. Anschließend löste dies den ER-assoziierten Abbau (ERAD) der NKA-beta-Untereinheit aus und verringerte die Transporterexpression an der Zellöberflache. Eine Hemmung der Ca2+-Freisetzung durch die IP3R-Rezeptoren stabilisierte die Anzahl von ER-residenten NKA-beta und erhöhte die Emission des Enzyms an der Plasmamembran. Dagegen führte eine langfristige Hyperkapnie (bis zu 72 Stunden) signifikant zu einer verminderten Freisetzung der NKA-beta-Untereinheit im ER, gefolgt von einer erhöhten Oxidation des ER-Proteins und einer Bildungsstörung des Transporter-alpha:beta-Komplexes. Darüber hinaus kam es zu einer adaptiv entwickelten Proteinreaktion durch eine aktivierte Störung der ER-Homöostase, indem die Phosphorylierung durch PERK von eIF2alpha erhöht wurde. Zusätzlich konnten wir zeigen, dass durch die Zugabe von alpha-Ketoglutarsäure zu den Hyperkanie-exponierten Zellen die Proteinoxidation im ER und die Freisetzung der Na, K-ATPase wiederhergestellt werden konnte.Zusammenfassend führt eine kurz- und langfristige Exposition mit erhöhten CO2-Spiegeln zu einer Fehlbildung der beta-Untereinheit im ER und einer verminderten Expression der Na, K-ATPase an der Plasmamembran, was zu einer verschlechterten Clearance der Alveolarflüssigkeit führen kann. Diese neu erworbenen Kenntnisse über die Mechanismen der durch Hyperkapnie induzierten respiratorischen Insuffizienz, könnten neue Ansätze in der Pathophysiologie und in der Behandlung von Patienten mit ARDS liefern.
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