Su, PingPingSu2023-03-032002-08-082023-03-032002http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:hebis:26-opus-8033https://jlupub.ub.uni-giessen.de/handle/jlupub/11289http://dx.doi.org/10.22029/jlupub-10672Die Natriumpumpe, eine P-Typ-ATPase, scheint zur Superfamilie der Hydrolysen zu gehören.Aufgrund ihrer Faltungsstruktur müßte sie alsL-2-Haloazid-Dehalogenase klassifiziert werden. In der Haloazid-Dehalogenase L-2-DEX YL dient die Aminosäure Lys151 derStabilisierung der überschüssigen negativen Ladung bei der Substratbindung bzw. der Entstehung von Reaktions-Zwischenprodukten.Asp180 koordiniert ein Wassermolekül, welches direkt bei der Hydrolyse des Ester-Intermediats beteiligt ist. Die beiden Aminosäurenkönnte Lys691 und Asp714 der Natriumpumpe entsprechen. Um ihre Bedeutung für die Katalyse zu untersuchen, wurden Mutanten dieserAminosäuren in Hefezellen exprimiert und ihre Eigenschaften untersucht. Die Mutationen Lys691Ala, Lys691Asp, Asp714Ala, und Asp714Arg waren völlig inaktiv. Die konservativen Mutanten Lys691Arg undAsp714Glu zeigten einige Teil-aktivitäten des Wildtyp-Enzyms, waren aber ohne ATPase-Aktivität. In Anwesenheit von Pi und Mg 2+ zeigtekeine der Mutanten eine Ouabainbindung: Der [E2*P·ouabain] Komplex konnte bei keiner der Mutanten gebildet werden. Ohne Zugabe vonMg 2+ zeigten die Lys691Asp- und Asp714Glu-Mutanten jedoch eine Ouabainbindung bei 5 mM Pi. Somit bewirkte Mg 2+ eine Reduktionder Ouabainbindung. Hefezellen, welche die Mutanten Lys691Arg oder Asp714Glu exprimierten, waren sensitiv gegenüber Palytoxin und verloren K + . IhreSensitivität gegenüber Palytoxin, mit einem EC50 Wert von 118 ± 24 nM bzw. 76,5 ± 3,6 nM war deutlich reduziert und lag sieben- bzw.vierfach unter der Sensitivät von Hefezellen, die den Wildtyp exprimierten (17,8 ± 2,7 nM). Dieser Palytoxin-induzierter K + -Efflux wurdedurch Ouabain gehemmt. Der EC50 Wert für den Ouabaineffekt betrug 131 ± 13 µM bei der Lys691Arg Mutanten und war 2,5 mM odergrößer bei der Asp714Glu Mutanten. Der entsprechende EC50 Wert nicht-mutierter Natriumpumpen lag bei 5.13 ± 0.71 µM. Isotopenaustauschexperimente mit 18 O-markiertem Pi zeigten bei der Mutanten Asp714Glu nur einen geringen 18 O Austausch mit demUmgebungswasser (H2 16 O) und keinen 18 O Austausch bei der Lys691Arg Mutante. Schlussfolgernd, Lys691 und Asp714 sind sehr wichtig für die Konformationsübergänge der Natriumpumpe. Das Lys691 ist wichtig für denPhosphorylierungsprozess, Asp714 für den Dephosphorylierungsprozess. Beide Aminosäuren Lys691 und Asp714 der alpha Untereinheitder Natriumpumpe sind hier als essentiell für die enzymatische Aktivität nachgewiesen worden.P-type ATPases such as the sodium pump appear to be the members of a superfamily of hydrolases structurally typified by theL-2-haloacid dehalogenases. In the haloacid dehalogenase L-2-DEX YL, Lys151 serves to stabilize the excess negative charge in thesubstrate/reaction intermediates and Asp180 coordinates a water molecule that is directly involved in ester intermediate hydrolyze. Toinvestigate the importance of the corresponding Lys691 and Asp714 of the sodium pump a subunit, sodium pump mutants were expressedin yeast and analyzed for their properties. The Lys691Ala, Lys691Asp, Asp714Ala, and Asp714Arg mutants were enzymatic inactive, not only with respect to ATPase activity, butalso to non interaction with the highly sodium pump-specific-inhibitors ouabain or palytoxin. In contrast, the conservative mutants Lys691Arg and Asp714Glu retained some of the partial activities of the wild-type enzyme, althoughthey completely failed to display any ATPase activity. In the presence of Pi and Mg 2+ , none of the mutant sodium pumps were able to bindouabain: the [E2*P·ouabain] complex was not able to be formed by the mutant enzymes.When Mg 2+ was omitted, however, bothLys691Asp and Asp714Glu mutants displayed ouabain binding only at 5 mM Pi. Mg 2+ caused a reduction in ouabain binding with an EC50of 0.76 ± 0.11 mM and 1.24 ± 0.21 mM, respectively. On the other hand, yeast cells expressing Lys691Arg and Asp714Glu mutants are sensitive to palytoxin and lose their intracellular K + .Their sensitivity to palytoxin, with EC50 value of 118 ± 24 nM and 76.5 ± 3.6 nM, respectively, was clearly reduced by almost 7- or 4-foldbelow that of the native sodium pump (17.8 ± 2.7 nM). In contrast to the binding experiments in the presence of Mg 2+ and phosphate, ouabain was recognized by the mutants under theseconditions and inhibited the palytoxin-induced K + efflux from the yeast cells. The EC50 for the ouabain effect was 131 ± 13 µM forLys691Arg, and greater than 2.5 mM for the Asp714Glu mutant, while the corresponding value obtained with cells expressing the nativesodium pump was 5.13 ± 0.71 µM. Experiments with 18 O-labeled Pi demonstrated that only a modest 18 O exchange with surrounding water occurred for Asp714 and no 18 Oexchange was detected with the Lys691Arg mutant. In conclusions, Lys691 and Asp714 are very important for the conformational transition of the sodium pump: Lys691 is essential for thephosphorylation process and Asp714 for the dephosphorylation process. Thus, Lys691 and Asp714 residues of the sodium pump alphasubunit are essential for the enzymatic activity.de-DEIn Copyrightddc:630