Analyse der Expression von GPR55 mRNA Spleißvarianten im Kontext der Replikation des Hepatitis-C-Virus - Jost, Elena; Justus Liebig University Giessen (My University, 2026)
Das Hepatitis-C-Virus ist ein hepatotropes, einzelsträngiges RNA-Virus aus der Gruppe der Flaviviridae. Weltweit leiden über 50 Millionen Menschen an einer HCV Infektion. Diese führt besonders durch eine Chronifizierung und Folgeerkrankungen wie Leberzirrhose und Hepatozelluläres Karzinom trotz mittlerweile etablierter, aber noch immer kostspieliger Therapie zu einer hohen Morbidität und Mortalität. HCV ist während seines Replikationszyklus auf Strukturen und Signalwege der Wirtszelle angewiesen. Die zugrundeliegenden Interaktionen sind noch immer nicht vollends erforscht. Um die von Hu et al. 2019 identifizierte proviral wirkende lnc-ITM2C-1 - GPR55 - ISG Regulationsachse weiter zu untersuchen, wurde sich in dieser Arbeit mit der Expressionsanalyse von GPR55 mRNA Spleißvarianten im Kontext der HCV Replikation befasst. Zur Identifikation der in nativen Huh-7 Zellen exprimierten GPR55 mRNA Spleißvarianten mittels RT-qPCR wurde zunächst das Protokoll zur Gesamt-RNA-Extraktion überarbeitet mit dem Ziel einer Verhinderung der RNA-Degradation und Reduktion kontaminierender gDNA. Das entwickelte Protokoll umfasste eine verlängerte Behandlung mit TRIzol, eine saure (pH 4,5) Phenol-Chloroform-Extraktion und die Aufreinigung mittels Kieselgel-Zentrifugationssäule. Die Entfernung von gDNA wurde mittels einer noRT-Kontrolle in der RT-qPCR und Gelelektrophorese bestätigt. Das neue Protokoll wurde erfolgreich in der Arbeitsgruppe etabliert. Die Untersuchung der 9 verschiedenen in den Datenbanken NCBI und Ensembl EBI gelisteten GPR55 mRNA Spleißvarianten erfolgte zunächst mittels bioinformatischer Alignments der einzelnen cDNA-Sequenzen an der GPR55 Gensequenz. Letztere wurde manuell aus den leicht abweichenden Annotationen aus NCBI und Ensembl als Hybridsequenz zusammengesetzt. Anhand der Alignments und der Exongrenzen wurden möglichst Varianten-spezifische qPCR-Primer erstellt und validiert. Mittels RT-qPCR und Gelelektrophorese wurde anschließend die Expression der Spleißvarianten 1 (NM_005683.4; ENST00000650999.1) und 3 (XM_011512175.4) in Huh-7 Zellen identifiziert. Die Expression der Spleißvariante 1 und 3 sowie die Expression aller GPR55 mRNA Spleißvarianten insgesamt wurden anschließend in HCV-transfizierten Huh-7 Zellen mit der Expression in Kontrollzellen verglichen. Es zeigte sich keine signifikante Änderung der GPR55 mRNA Expression 48 h nach HCV Transfektion, weder für die einzelnen Varianten 1 und 3 noch für die Gesamtheit aller GPR55 Spleißvarianten. Die erstellten und validierten GPR55 Primer für die damit identifizierten Spleißvarianten in Huh-7 Zellen sind der Grundstein für weitere Analysen der lnc-ITM2C-1 - GPR55 - ISG -Regulationsachse in der Arbeitsgruppe. Sie werden im Verlauf für Untersuchungen mit GPR55 mRNA Überexpression durch Plasmide verwendet werden. Durch den Nachweis der Spleißvariante 3 wurde die GPR55 Genannotation aus NCBI bestätigt. Die abweichende Annotation aus Ensembl EBI wurde bis dato (Januar 2025) nicht angepasst. Nach den Erkenntnissen aus dieser Arbeit sollten die gelisteten GPR55 Transkripte in den Datenbanken NCBI und Ensembl EBI kritisch überarbeitet und ggf. zusammengefasst werden. Auch die Sequenzgrenzen der Genannotation in Ensembl EBI sollte entsprechend der Annotation in NCBI angepasst werden.
Keywords: Hepatitis-C-Virus; GPR55; Spleißvarianten; ddc:610