Grösse und Populationsverteilung des Hepatitis-C-Virus : eine nanometrische Anwendung der Gel-Ausschluß-Chromatographie - Jonas, Tilo Renk; Justus Liebig University Giessen (My University, 2005)
Trotz erheblicher Anstrengung ist die Morphologie des Hepatitis-C-Virus (HCV), insbesondere seine tatsächliche Partikelgröße, unklar. Bisherige Studien mittels Elektronenmikroskopie führten zu keinen klaren Aussagen, auch bei vielen anderen Viren bietet diese Methodik kein genaues Ergebnis für die tatsächliche Größe hydrierter, nativer Viruspartikel. Ziel der vorliegenden Arbeit war, die Größe von HCV in nativem Zustand wie auch seine Populationsverteilung in humanem Serum zu ermitteln. Hierzu wurde eine Gel-Ausschlusschromatographie (GEC) etabliert, zu deren Auswertung ein hier dargelegtes mathematisches Verteilungsmodell mittels Weibull-Analyse erstmalig eingesetzt und validiert wurde. Zur Eichung wurden mehrere Viren mit bekannter cryoelektronenmikroskopischer Größe verwendet und zu ihrem Nachweis quantitative real-time Methoden etabliert. Bei der Untersuchung von HCV konnten im Serum Antikörper-gebundene von freien Viruspopulationen getrennt werden; freie Viren fanden sich vorwiegend bei Immunsupprimierten und in der frühen Infektionsphase. Die Größe des freien HCV wurde zu 37 +/- 2 nm bestimmt, was etwa 20% unter dem Wert anderer Mitglieder der Flaviviridae und dem für HCV bisher vermuteten Wert liegt. Neben diesen Partikeln fanden sich kleinere, RNA-freie Core-Ag-haltige Partikel, womit erstmalig der Nachweis subviraler HCV-Partikel gelang. Diese Partikel könnten eine wesentliche Rolle bei der Pathogenese und Diagnostik der Hepatitis C einnehmen. Nach chromatographischer Reinigung von humanem Serum gelang eine elektronenmikroskopische Darstellung von Partikeln mit möglicher viraler Oberflächenmorphologie. Weitergehend wurde die Größe von freiem Hepatitis-B-Virus (50,2 nm) und dem Bovinen Virus-Diarrhoe-Virus BVDV (48,6 nm) mittels GEC bestimmt. Die hier nachgewiesene deutliche Differenz zwischen BVDV und HCV stellt die bisherige Verwendung von BVDV als Modellvirus bei der Ultrafiltration in Frage. Das Fehlen von nachweisbarer RNA oder Kapsiden nach Detergenzbehandlung von HCV führt zu einer Neubewertung der HCV-Morphologie und zu der Hypothese, daß das HCV-Core-Protein eher ein Matrixprotein als ein klassisches Kapsidprotein ist.

Although great efforts were made in the past, the morphology of the Hepatitis-C-Virus (HCV) especially its size- is not evaluated very well. In many cases the electron-microscopy was used to answer this question, but the results differ. Furthermore, the method is not always useful to determine the size of native, hydrated virus particles. Aim of this work was the determination of the size of the native HCV and its sub-populations in human sera. Therefore the gelexclusionchromatography (GEC) was used. To evaluate the results, the use of Weibull s distribution was established first time for the use in GEC. Calibration points were different viruses with known diameter, measured by cryo-eloectronmicroscopy. For the detection of these viruses, quantitative real-time PCR-methods for viral nucleic acids were developed. When examinating HCV in human sera, we were able to separate antibody-linked viruses from free viruspopulations; free virus particles were mostly found in the earlyphase and in immune-suppressed patients. The size of free HCV virions were determined to 37 nm +/- 2nm, which is about 20% less than the expected size of HCV and of other members of the flaviviridae. Additional smaller, RNA-free particles containing HCV-core antigen were detected, showing first time the existence of subviral HCV-particles. These particles could be very important for further works on the pathogenicity and diagnosis of HCV. Furthermore the size of free Hepatitis B virus (50.2 nm) and bovine viral-diarrhea-virus BVDV (48.6 nm) was determined by GEC. The sizedifference between HCV and BVDV shows that BVDV is not suitable as a modelvirus for the ultrafiltration of HCV. Based on the fact, that it was not able to detect viral RNA or capsids after treatment of the virus with detergents, the morphology of HCV has to be reconsidered; HCV core protein may be more a viral matrix protein than a classical capsid protein.
Size determination of Hepatitis C Virus by Gel exclusion chromatography
Keywords: HCV; Größe; GEC; Weibull; subvirale Partikel; HCV; size; GEC; Weibull; subviral; ddc:610