Posttranskriptionelle Regulation bakterieller Photosynthesegene durch die Ribonuklease E und die antisense RNA asPcrL - Reuscher, Carina Maria; Justus Liebig University Giessen (My University, 2020)
Bakterien müssen auf sich ständig ändernde Umweltbedingungen reagieren und ihr Transkriptom entsprechend anpassen können. Dies wird nicht nur durch die Regulation der Transkriptionsrate der RNAs, sondern auch durch die posttranskriptionelle Regulation erreicht. Da RNasen die Degradation und Prozessierung der unterschiedlichen RNA-Spezies katalysieren, spielen sie eine wichtige Rolle in der posttranskriptionellen Regulation. In dieser Arbeit wurde die RNase E-Mutante rneE.c.ts charakterisiert, die statt der endogenen RNase E aus R. sphaeroides, ein rne-Allel aus E. coli trägt, wodurch ein thermosensitives Enzym gebildet wird, welches bei einer Inkubation bei 42°C inaktiviert werden kann. Durch RNA- Sequenzierung und anschließende bioinformatische Analysen, konnten die Genom-weiten RNase E-Schnittstellen und die, in der Mutante angereicherten, 5´-Enden bestimmt werden. Dadurch konnte die Bedeutung der RNase E-abhängigen RNA-Reifung und des RNA- Umsatzes in unterschiedlichen mRNAs, rRNAs und sRNAs bestimmt werden. Eine phänotypische Charakterisierung der rneE.c.ts-Mutante im Vergleich zum Wildtyp zeigte, dass die Mutante unter phototrophen Bedingungen ein starkes Wachstumsdefizit aufwies, während dieser unter chemotrophen Bedingungen nicht beobachtet werden konnte. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass die RNase E-Mutante sensitiver gegenüber oxidativem Stress ist, als der Wildtyp. Neben den RNasen sind auch kleine nicht-kodierende RNAs, die die Expression ihrer Ziel-mRNAs regulieren können, an der posttranskriptionellen Regulation der Genexpression beteiligt. In früheren Studien konnten bereits die zwei sRNAs PcrZ und PcrX identifiziert werden, die jeweils Teil eines incoherent feed-forward loops sind und die Expression der Photosynthesegene regulieren können. In dieser Arbeit konnte mit asPcrL die erste antisense RNA identifiziert werden, die die Expression der Photosynthesegene in R. sphaeroides beeinflusst. asPcrL ist auf dem Gegenstrang des puf-Operons lokalisiert, welches unter anderem die Pigment-bindenden Proteine des Reaktionszentrums (pufLM) und des Lichtsammelkomplexes I (pufBA) kodiert. Dabei überspannt asPcrL das 5´-Ende von pufL und einen Teil der interzistronischen Region von pufAL. Eine Überexpression der asRNA führt zu einem Wachstumsdefizit unter phototrophen Bedingungen und zu einer Reduktion der für die Photosynthese benötigten Pigmente. Durch die direkte Bindung an ihre Ziel-mRNA pufL wird das pufBALMX-Fragment in vivo destabilisiert. In vivo und in vitro Experimente zeigen, dass die pufL-mRNA durch die RNase III in Abhängigkeit von asPcrL prozessiert wird. Da die Expression von asPcrL von denselben Proteinregulatoren wie das puf-Operon aktiviert wird, konnte mit asPcrL die dritte sRNA identifiziert werden, die Teil eines incoherent feed-forward loops ist und das fine-tuning der Expression der Photosynthesegene beeinflusst.

Bacteria have to react to constantly changing environmental conditions and adapt their transcriptome accordingly. This is achieved not only through the regulation of the transcription rate of the RNAs but also through post-transcriptional regulation. RNases, which catalyze the degradation and processing of the different RNA species, play an important role in post- transcriptional regulation. In this work, the RNase E mutant rneE.c.ts was characterized. This mutant strain carries an rne-allele from E. coli instead of the endogenous rne-allele from R. sphaeroides. Furthermore the rne-allele from E. coli codes for a thermosensitive RNase E enzyme, which can be inactivated by an incubation at 42°C. By applying RNA sequencing and subsequent bioinformatic analyzes, the genome-wide RNase E cleavage sites and the 5´-ends enriched in the mutant strain could be determined. As a result, the importance of RNase E- dependent RNA maturation and RNA turnover for different mRNA, rRNAs and sRNAs could be revealed. Phenotypic characterization of the rneE.c.ts mutant compared to the wild type showed a strong growth deficit of the mutant under phototrophic conditions, whereas this could not be observed under chemotrophic conditions. Furthermore, it could be shown that the rneE.c.ts mutant is more sensitive to oxidative stress than the wild type. In addition to the RNases, small non-coding RNAs, which can regulate the expression of their target mRNAs by different mechanisms, are also involved in the post-transcriptional regulation of gene expression. Previous studies have already identified two sRNAs, PcrZ and PcrX, each of which is part of an incoherent feed-forward loop. Both can regulate the expression of the photosynthetic genes. In the present work, asPcrL was identified as the first antisense RNA that influences the expression of the photosynthetic genes in R. sphaeroides. asPcrL is transcribed from the opposite strand of the puf operon, which encodes the pigment-binding proteins of the reaction center (pufLM) and light-harvesting complex I (pufBA). AsPcrL spans the 5´ end of pufL and a part of the intercistronic region of pufAL. Overexpression of the asRNA leads to a growth deficit under phototrophic conditions and to a reduction in the pigments required for photosynthesis. The direct binding of asPcrL to its target mRNA pufL leads to the destabilization of the pufBALMX-fragment in vivo. In vivo and in vitro experiments show that the pufL mRNA is processed by RNase III depending on asPcrL. Since the expression of asPcrL is activated by the same protein regulators as the puf operon, asPcrL the third sRNA, which is part of an incoherent feed-forward loop and influences the fine-tuning of the expression of the photosynthetic gene.
Keywords: ddc:570