Erprobung einer CRISPR/Cas9-basierten knock-out-Strategie für humane DNA-Ligasen und Analyse des Effektes auf die DNA-Reparatur

Abstract

Genome editing unter Verwendung des CRISPR/Cas9-Systems stellt einen vielversprechenden Ansatz zur Therapie genetisch bedingter Erkrankungen wie zum Beispiel erblicher Netzhautdystrophien dar. Die Korrektur pathogener Mutationen erfolgt dabei im Rahmen der Reparatur Cas9-induzierter Doppelstrangbrüche (DSBs) durch die zelleigenen DSB-Reparaturmechanismen wie Nonhomologous end joining (NHEJ), Homology-directed repair (HDR) und Microhomology-mediated end joining (MMEJ). Die DSB-Reparatur wird dabei durch die Mechanismus-spezifischen DNA-Ligasen 1, 3 und 4 komplettiert. Das Ergebnis der Korrektur ist dabei u.a. davon abhängig, welcher DSB-Reparaturmechanismus für die Reparatur verwendet wurde, sodass ein genaues Verständnis und Manipulationsmöglichkeiten der Reparaturmechanismen für die Entwicklung von Genome editing-basierten Therapiestrategien bedeutsam sind. Ziel der vorliegenden Arbeit war daher die Erprobung einer CRISPR/Cas9-basierten „knock-out“ (KO)-Strategie für die drei humanen DNA-Ligasen in einem Luziferase-basierten Assay zu MMEJ-vermitteltem Genome editing und einem Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET)-basierten Assay zu NHEJ-vermittelter DNA-Reparatur. Des Weiteren wurde mittels Western Blot und ELISA nach FACS-Anreicherung erfolgreich transfizierter Zellen der Versuch unternommen, eine Abnahme der DNA-Ligase-Proteinmenge in den Zellen nach Anwendung der DNA-Ligase-KO-Strategie nachzuweisen. Ein MTT-Assay diente der Evaluation möglicher toxischer Effekte der verwendeten DNA-Ligase-KO-Strategie. Die Durchführung der Versuche erfolgte an HEK-Zelllinien. Bei Anwendung der DNA-Ligase-KO-Strategie konnten im Assay zu MMEJ-vermitteltem Genome editing eine verringerte Luziferaseaktivität in Abhängigkeit von der verwendeten Mikrohomologiearmlänge und der individuellen DNA-Ligase, welche ausgeknockt wurde, beobachtet werden. Dies ist ein möglicher Hinweis auf einen verringerten Einbau der Luziferase-Sequenz in das zelluläre Genom. Im Assay zu NHEJ-vermittelter DNA-Reparatur konnte ein Anstieg der BRET-Ratio bei KO der NHEJ-assoziierten DNA-Ligase 4 beobachtet werden, als möglicher Hinweis auf eine verringerte NHEJ-Aktivität. Die Durchführung des ELISA nach FACS-Anreicherung erfolgreich transfizierter Zellen nach Anwendung der DNA-Ligase-KO-Strategie erbrachte einen ersten Hinweis auf einen verringerten Proteingehalt der DNA-Ligasen 1 und 3 in HEK 293T-Zellen. Im MTT-Assay konnten in einem Zeitraum von 24 h keine negativen Effekte der verwendeten DNA-Ligase-KO-Strategie auf die Stoffwechselaktivität von HEK 293T-Zellen nachgewiesen werden. Zusammenfassend ergaben sich erste Hinweise auf eine Beeinflussung der DNA-Reparatur in den verwendeten Assays in humanen Zellen durch die verwendete DNA-Ligase-KO-Strategie. Es konnten erste Hinweise auf eine verringerte Expression der DNA-Ligasen 1 und 3 nach Anwendung der betrachteten DNA-Ligase-KO-Strategie erhalten werden. Des Weiteren scheint die verwendete DNA-Ligase-KO-Strategie keine negativen Effekte auf die Viabilität von HEK 293T-Zellen in einem Zeitraum von 24 h zu haben.