Identifizierung von Interaktionspartnern des response Regulators RegA aus Rhodobacter capsulatus

Abstract

Rhodobacter capsulatus ist ein fakultativ phototrophes Purpurbakterium, das unter anaeroben Bedingungen in der Gegenwart von Licht inder Lage ist, eine anoxygene Photosynthese zu betreiben. Fällt der Sauerstoffpartialdruck in der Umgebung unter einen Schwellenwert, sobeginnt Rhodobacter mit der Herstellung der Photosynthesekomplexe. In der sauerstoff-regulierten Synthese des Photosyntheseapparatesspielt das RegB/RegA-Zweikomponentensystem eine wichtige Rolle. Die membrangebundene Sensorkinase RegB autophosphoryliertwenn der Sauerstoffgehalt der Umgebung fällt und überträgt eine Phosphatgruppe auf den response Regulator RegA. PhosphoryliertesRegA reguliert dann die Transkription von zahlreichen Zielgenen. Zu diesen Zielgenen gehören, neben den Genen, die zur Herstellung desPhotosyntheseapparates benötigt werden, auch solche Gene, die für Stickstoff-Fixierung, Kohlendioxid-Fixierung und eine Reihe weitererProzesse, notwendig sind. RegA ist damit ein globaler Transkriptionsregulator, der die Transkription zahlreicher verschiedener Gene beiniedrigem Sauerstoffpartialdruck aktiviert bzw. in einigen Fällen auch reprimiert. Neben dem RegB/RegA Zweikomponentensystem sindeine Vielzahl weiterer Faktoren an der Regulation der einzelnen Gene beteiligt. Daher ist es denkbar, dass der response Regulator RegAeine Wechselwirkung mit anderen Proteinen eingeht, um eine spezifische Regulation der einzelnen Prozesse zu gewährleisten. Für dieSuche nach solchen interagierenden Proteinen wurde in dieser Arbeit das Hefe 2-Hybridsystem eingesetzt. Mit dieser Methode konnte derresponse Regulator NtrX als Interaktionspartner von RegA identifiziert werden. Das zugehörige Zweikomponentensystem bestehend ausder Sensorkinase NtrY und dem response Regulator NtrX ist in Azorhizobium caulinodans an der Regulation vonStickstoff-Fixierungsgenen beteiligt. Zur transkriptionellen Regulation dient in A. caulinodans der nifA-Promotor, der in R. capsulatus unteranderem unter der Kontrolle des RegB/RegA-Zweikomponentensystems steht. Die Interaktion von RegA und NtrX konnte anschließend miteinem GST-pulldown assay verifiziert werden, bei dem eine Kopräzipitation beider Proteine in vitro festgestellt werden konnte.NtrX-Deletionsmutanten von R. capsulatus zeigten deutlich veränderte Zusammensetzungen innerhalb der Photosynthesekomplexe, dieabhängig vom Ammoniumgehalt des verwendeten Mediums waren. Weiterhin wiesen die NtrX-Mutanten höhere Mengen anPhotosynthesekomplexen auf, verglichen mit dem Wildtyp. Bei einer Überexpression von NtrX in R. capsulatus dagegen ist die Menge anPhotosynthesekomplexen um 30 % niedriger als im Wildtypstamm. NtrX könnte also ein negativer Regulator derPhotosynthesegenexpression sein. Eine NtrX-Variante, bei der die putative Phosphorylierungsstelle D52 gegen Glutamat ausgetauschtwurde, zeigte in Gelretardationsexperimenten eine Bindung an den Promotor des Photosynthese-Operons puf (kodiert u. a. Proteine fürAntennenkomplex I und Reaktionszentrum). Diese DNA-Bindung von NtrX deutet darauf hin, dass das Protein durch direkteWechselwirkung mit der Ziel-DNA einen Einfluss auf die Menge der Photosynthesekomplexe nehmen kann. Rhodobacter capsulatus is a facultatively phototrophic purple bacterium. It is able to perform anoxygenic photosynthesis under anaerobicconditions in the presence of light. The formation of pigment protein complexes in facultatively photosynthetic bacteria of the genusRhodobacter is only induced when the oxygen tension drops below a threshold value. In R. capsulatus the sensor kinase RegBautophosphorylates in a redox-dependent manner. It then transfers the phosphatidyl residue to the response regulator RegA, a DNAbinding protein which activates transcription of a number of genes for pigment binding proteins and for pigment syntheses. Among thegenes activated by RegA at low oxygen tension are the genes of the puf and puc operons. The puf operon comprises genes encodingpigment binding proteins of the light harvesting (LH) I complex and of the reaction center complex, and regulatory proteins. Genes requiredfor the formation of the LH II complex are part of the puc operon. The RegB/RegA two component system is also involved inredox-dependent regulation of genes for nitrogen fixation, Calvin cycle enzymes, hydrogenase, and for enzymes of the respiratory chain. Inorder to test whether the coregulation of different redox-controlled regulons also involves a direct interaction of regulatory proteins the yeasttwo-hybrid system was applied to search for proteins interacting with the response regulator RegA. NtrX, the response regulator of theNtrY/NtrX two component system was identified as interaction partner of RegA. In Azorhizobium caulinodans the NtrY/NtrX two componentsystem is involved in the regulation of nitrogen fixation genes. The interaction of RegA and NtrX was confirmed by GST pulldownexperiments. To learn more about the role of NtrX in R. capsulatus, Rhodobacter strains were constructed, which harbor a knock-out of thechromosomal ntrX gene. These mutants showed a different composition of their photosynthetic components compared to the wild type. Thechange in composition was dependent on the amount of ammonium added to the medium. Additionally, all NtrX mutants showed morephotosynthetic complexes than the wild type strain. When NtrX was overexpressed in R. capsulatus the cells contained lower amounts ofphotosynthetic complexes than wild type cells. NtrX seems to be a negative regulator of the photosynthetic complexes in R. capsualtus.Since NtrX has a typical helix-turn-helix motif for DNA-binding, gel retardation assays should show, whether NtrX can directly interact withthe promoter regions of the photosynthesis operons puf and puc. An interaction of NtrX with the puf promoter region was only detectable,when a NtrX variant was used in the gel retardation assay. This NtrX variant harbored an amino acid exchange at the putuativephosphorylation site of the protein so that the conserved aspartate at position 52 was changed to glutamate. Theses results lead to thesuggestion that the NtrX mediated negative regualtion of photosynthetic complexes in R. capsulatus is due to a direct interaction of NtrXwith the puf promoter region.