In vivo und in vitro Untersuchungen zur Rolle des Insulin-ähnlichen Wachstumsfaktors-II im Schweineherzen, IGF-II transgenen Mäusen und Myoblasten

Abstract

Der Insulin-ähnliche Wachstumsfaktor-II (IGF-II) spielt eine zentrale Rolle bei der Proliferation und Differenzierung von Zellen. Für dasporcine IGF-II sind mehrere mRNAs beschrieben. Die 6.0 kb mRNA ist nach dem Okklusion/Reperfusionsmodells im Herzen induziert.Exogen appliziertes IGF-II wirkt kardioprotektiv und verringert den infarzierten Bereich im Schweineherzen. Ziel dieser Arbeit war es,Aufschluß über die Rolle des IGF-II in Myoblasten zu bekommen. Es sollte untersucht werden, welcher Promotor für die durch Ischämie- undStress-induzierte 6.0 kb mRNA verantwortlich ist. Eine genomische Karte des Schweinegens galt es zu erstellen und anhand vontransgenen Mäusen und einer Myoblasten-Zellkultur sollte die Regulation des IGF-II in Myoblasten näher betrachtet werden. Die Ergebnisseder vorliegenden Untersuchungen an Gewebeproben aus dem Myokard des Schweins weisen auf eine ähnliche Struktur des humanen undporcinen IGF-II-Gens hin. Promotor P1 und P2 sind für die Transkription der 6.0 kb mRNA verantwortlich. Auch konnte eine 6.0 kbAntisense-RNA nachgewiesen werden. Die herzspezifische Überexpression von humanem IGF-II in Mäusen scheint von Nachteil für dieEntwicklung zu sein, da lediglich ein Foundertier gefunden wurde und die Nachkommenzahl der heterozygoten Tiere vermindert war. In vitroUntersuchungen in Myoblasten zeigten, daß die Expression des endogenen IGF-II von der Zelldichte abhängt. Dies deutet auf eine positiveRückkopplung bei der Regulation des IGF-II hin. Die Überexpression bewirkte eine Vergrößerung der Zellen und hemmte dieDifferenzierungsfähigkeit zu Myotuben. Wie in den transgenen Mäusen konnten auch in der Zellkultur Sense- und Antisense-RNAs des H19nachgewiesen werden. Vergleichbar mit dem Schweineherzen war eine IGF-II Antisense-RNA auch in den nicht transfizierten Myoblastenzu detektieren. Der IGF-II Rezeptor, der die IGF-II-Konzentration reguliert, war in den IGF-II überexprimierenden Myoblasten induziert.Neben dem genomischen Imprinting spielt also auch die Regulation über Antisense-RNA eine Rolle. Exogenes IGF-II hemmt dieExpression der IGF-II-Antisense-RNA und der H19 Sense-mRNA, hat aber keinen Einfluß auf die Transkription der Antisense-RNA desH19. Umgekehrt scheint IGF-II in seiner Expression nicht von H19 beeinflußt zu sein. Parallel zu seinen kardioprotektiven Effekten hat IGF-IIauch negativen Einfluß, seine Wirkung ist ambivalent. The Insulin-like growth factor-II (IGF-II) plays a central role in proliferation and differentiation of cells. Several mRNAs are described for theporcine IGF-II. One of these mRNAs with a size of 6.0 kb mRNA is induced in the porcine heart after occlusion of a coronary artery andreperfusion. Exogenous application of IGF-II has cardioprotectiv effects and reduces the infarct area of the porcine heart in the describedmodel. The aim of this study was to get more information on the role of IGF-II in myoblasts. It should be analysed which promoter may beactivated by ischaemia and stress generating the 6.0 kb mRNA. A genomic map of the porcine IGF-II gene should be created. Furthermore,transgenic mice with heart-specific overexpression of IGF-II should be created and studied, together with myoblast cell culture focusing onthe regulation of IGF-II in myoblasts. The results of this study show that the porcine and the human IGF-II gene have a similar structure.Promoter P1 and P2 are responsible for the transcription of the 6.0 kb mRNA in pig myocardium. Additionally, a 6.0 kb antisense-RNAcould be detected. The heart specific overexpression of the human IGF-II cDNA in transgenic mice is of disadvantage for the developmentof the animal, indicated by the fact that only one founder animal was detected and the size of the offspring of heterozygous animals wasreduced. In vitro analysis in myoblasts showed that the expression of the endogenous IGF-II is cell-density dependent. This points to apositive feedback-loop in the IGF-II regulation. Overexpression of IGF-II causes an enlargement of the cells and inhibits the ability todifferentiate into myotubes. Similar to the IGF-II transgenic mice sense- and antisense-RNAs of H19 were detected in the cell culture model.Comparable with the porcine heart an antisense-RNA of IGF-II was found in the untransfected myoblasts. The IGF-II receptor, whichregulates the concentration of its ligand IGF-II, was induced in the IGF-II overexpressing myoblasts. Therefore, in addition to genomicimprinting, antisense-RNA may play a role in this epigenetic regulation. Exogenous IGF-II inhibits the expression of IGF-II antisense-RNAand H19 sense-mRNA, but it has no influence on the transcription of the H19 antisense-RNA. Vice versa, IGF-II transcription seems not tobe affected by H19. In summary, IGF-II has cardioprotective and negative effects as it has ambivalent characteristics.