Mammalian TRX2 function

Abstract

Mitglieder der trxG und PcG Proteinfamilie in Drosophila sind epigenetische Regulatoren, deren Aktivität für die Aufrechterhaltung eines ordnungsgerechten Genexpressionsmusters der homeotischen Gene während der Embryonalentwicklung der Fliege verantwortlich ist. Beide Proteinfamilien erreichen ihre entgegengesetzten Wirkungsweisen durch Einflussnahme auf den aktivierten oder reprimierten Chromatinstatus der Zelle. Während fuer MLL als Säugerprotein aus der trxG Familie schon nachgewiesen wurde, dass es die Expression der Hoxgene beeinflusst, ist Wirkungsweise, Zielgruppe und zelluläre Lokalisation des zweiten bekannten Säugetierhomologs TRX2 noch weitestgehend unerforscht. Der Schwerpunkt dieser Arbeit stützt sich deshalb auf die Untersuchung der Grundfunktionen des Säugerproteins TRX2 waehrend der Embryonalentwicklung der Maus.Das Gelingen der Herstellung einer embryonalen Stammzellinie (ES) die einen homozygoten knock-out des Trx2 Gens traegt, und deren Analyse ergab, dass Lebensfunktionen und Zellzykluskontrolle im totipotenten Stadium der ES Zelle durch den Verlust des TRX2 Proteins nicht beeinträchtigt sind. Eine N-terminale Fusionierung von TRX2 an das gelb-fluoreszierenden Proteins (EYFP) diente ausserdem als Werkzeug, um die subzelluläre Lokalisation des Proteins in ES Zellen zu studieren. Die Analyse des hypomorphen Phenotyps von EYFP-Trx2 homozygoten Mäusen ergab, dass intaktes TRX2 auch während später Phasen der embryonalen, fötalen und adulten Entwicklung nötig ist. Diese Beobachtung wurde weiter durch Injektionsexperimente von Trx2-/- ES Zellen in Blastocysten unterstützt. Schwach chimäre Embryonen, die aus dieser injizierten Blastozyste hervorgehen, zeigen eine variable aber allumfassende Mitwirkung der knock-out Zellen bis zum embryonalen Stadium E10.5. Allerdings zeigte sich dann eine zunehmende Eliminierung der Trx2-/- Zellen bis zum Embryonalstadium E18.5. Sobald die Beteiligung der -/- Zellen in den untersuchten Embryonen einen bestimmten Grenzwert überschritt, zeigten solch hoch-chimäre Embryonen einen Phenotyp, der den von Trx2 knock-out Embryonen widerspiegelt. Durch diese Beobachtung kann gefolgert werden, dass die fehlerhafte Embryonalentwicklung nicht durch einen Defekt im extraembryonalen Gewebe, sondern durch das Fehlen von TRX2 im eigentlichen Embryo hervorgerufen wird. Drosophila trxG and PcG proteins are epigenetic regulators whose activity is required to maintain the proper expression pattern of homeotic genes during fly embryonic development. Both protein families have shown to convey their opposing effects by influencing the open or repressed states of chromatin. While some mammalian members of trx-G like Mll have already been proven to have a regulatory influence on expression of the Hox genes, the action, target genes and localization of the second mammalian homologue Trx2 remains mostly unexplored. Work in this thesis has focused on the study of mammalian TRX2 function during mouse embryonic development. Successful generation and analysis of a knockout Trx2 ES cell line allowed us to conclude that viability and cell cycle regulation is not altered by loss of TRX2 in the totipotent state of embryonic stem cells. By an N-terminal fusion of the Enhanced Yellow Fluorescent Protein (EYFP) to murine TRX2 we have created a tool to study TRX2 sub cellular localization in Embryonic Stem (ES) cells. Analysis of the hypomorphic phenotype of EYFP-Trx2 homozygous mice enabled us to draw conclusions about the requirement of functional TRX2 in late phases of embryonic, fetal and adult development, an observation that is further supported by blastocyst injection experiments of Trx2-/- ES cells. Low chimeric embryos display a variable but overall contribution of Trx2 -/- cells until E10.5, but progressive elimination of knockout cells until E18.5. If the contribution of -/- cells was about a certain threshold those highly chimeric embryos reflected the phenotype of Trx2 knockout mice ensuring that the Trx2-/- phenotype is not caused by a defect in the extraembryonal tissue but in the embryo proper. All performed experiments indicate that Trx2 is continuously required during development in a cell-type unspecific and cell-autonomous manner.