Studies on reverse genetic systems for avian influenza virus and the Borna disease virus

Abstract

Reverse Genetik-Systeme haben sich als nützliche Werkzeuge für die Analyse des viralen Replikationzyklus, der regulatorischen Funktion viraler Proteine und molekularer Pathogenitätsmechanismen erwiesen. Wissenschaftler haben sehr viel an reversen Genetik-Systemen für humane Influenza Viren gearbeitet, aber kaum für AIV. BDV ist immer noch eine mysteriöses Virus, zu dem es noch viele ungeklärte Fragen gibt. In dieser Studie habe ich versucht ein reverses Genetik-System für das aviäre Influenza Virus A/Goose/Guangdong/1/96 (H5N1) und BDV zu etablieren. In dem ersten Teil meiner Arbeit wurden zur Erstellung eines reversen Genetik-System acht Pol I-Plasmide konstruiert, welche die kompletten cDNAs der acht Genomsegmente von A/Goose/Guangdong/1/96 (H5N1) enthalten. Da bei Arbeiten mit Influneza Viren vom Subtyp H5N1 die biologische Sicherheit berücksichtigt werden muß habe ich versucht Reassortante Viren zu generieren, welche als genetischen Hintergrund jeweils sieben Gensegmente des aviären Influenza Virus A/FPV/Rostock/34 (H7N1) (FPV, Laborstamm) und eins von A/Goose/Guangdong/1/96 (H5N1) enthalten. Hierdurch sollten meine neuen Plasmide funktionell getestet werden. Mindestens fünf Plasmide waren funktionsfähig, wie sich sowohl durch direkte (CAT-Analyse) als auch indirekte Untersuchungen (Erzeugung eines Reassortanten Virus) zeigen ließ. Das Reassortante Virus GD1NSFPV, welches das NS-Segment von A/Goose/Guangdong/1/96 (H5N1) und die übrigen Segmente von FPV enthält, unterscheidet sich in seinen Vermehrungseigenschaften signifikant von dem Wild Typ FPV. Zur Untersuchung worin dieser Unterschied begründet liegt, habe ich die virale Induktion der Raf/MEK/ERK-Signalkaskade durch beide Viren analysiert, da diese zelluläre Kaskade für die Bildung infektiöser Viren wichtig ist. Da das NS1-Protein ein wichtiger Pathogenizitätsfaktor der viralen Replikation ist habe ich auch das NS1-Protein beider Viren näher untersucht. Die Ergebnisse zeigten keine großen Unterschiede in der Aktivierung der Raf/MEK/ERK-Kaskade, was darauf hindeutet, daß hierin kein wichtiger Grund für die unterschiedlichen Wachstumseigenschaften der beiden Viren liegen kann. Mit der Hilfe von zwei Proteindomänen übt das NS1-Protein seine proviralen Funktionen aus. Teilweise durch Bindung freier RNA (dsRNA/mRNA), wodurch die Aktivierung zellulärer Verteidigungsmechanismen verhindert wird und die Translationseffizienz zellulärer mRNA zum Vorteil der Virusvermehrung reduziert wird. Die Aminosäuresequenz des NS1-Proteins von GD1NSFPV unterschiedet sich von der des FPV-NS1 speziell in der RNA-Bindungs- und in der Effekor-Domäne. Darüber hinaus resultieren dieses Unterschiede in einer Änderung der Hydrophilizität beider Proteine. Außerdem zeigte es sich, daß das reassortante GD1NSFPV Virus deutlich effizienter die zelluläre Interferonexpression unterdrückt, welche ein wichtiger initialer Schritt in der Etablierung der zellulären Immunität darstellt. Trotzdem muß der eigentliche Grund für die unterschiedlichen Vermehrungseigenschaften noch genauer bestimmt werden. Die Studien zur Pathogenität der Reassortante GD1NSFPV werden zukünftig durch Tierexperimente in China untersucht. Im zweiten Teil meiner Arbeit habe ich, auf Grundlage neuer Daten (die Existenz eines 'A'-Nukleotids am äußerten 3´-Ende der genomischen Einzelstrang-RNA von BDV und einem 'U'-Nukleotid am 5´-Ende), neue Pol I-Expressionskonstrukte erstellt, die ein Reportergen (CAT) expremieren. Die Pol I-Transkripte beginnen mit einer 'Hammerhead' Ribozymsequenz (HHR), die mit einem 'A' startet, da die RNA-Polymerase I normalerweise nicht 'U' als erstes Nukleotid einbaut. Ich konnte zeigen, daß die HHR-Versionen die Transkripte in cis schneiden und so neue 5´-Enden generieren, die mit dem genomischen 'U' als erstes Nukleotid beginnen, und das die korrekten 3´-Enden der Transkripte durch ein Hepatitis Delta Virus-Ribozym (HDV) erzeugt werden, welches ebenfalls in cis schneidet. Darüber hinaus konnte ich zeigen, daß die korrekten Enden auch in vivo durch die beiden Ribozyme erzeugt werden, und das die BDV-Polymerase das antigenomische Mini-Transkript in einem BDV-abhängigen System repliziert und transkribiert. Weiterhin zeigen RPA-Ergebnisse, daß das putative Polyadenylierungssignal in der 3´-Nichtkodierenden-Region (NCR) wirklich von der viralen Polymerase genutzt wird. Zusätzlich konnte ich zeigen, daß das von dem Pol I-Expressionkonstrukt erzeugte Mini-Genom in einem plasmidbasierten reversen Genetik-System funktionell ist und dabei publizierte Daten bestätigen die zeigen, daß dieser Prozeß von einem empfindlichen Verhältnis zwischen BDV-Proteinen N und P abhängt. Both, avian influenza virus (AIV) and the Borna disease virus (BDV), are negative-strand RNA viruses, that replicate and transcribe their genomes in the nucleus of infected cells. Influenza A viruses can infect mammals and all species of birds and AIV have caused enormous losses and heavy shocks to avian industries worldwide. These viruses are also potential threats to human health. Specifically, the avian H5N1 influenza virus was directly transmitted from birds to humans and led to the death of 6 of 18 infected people in Hongkong in 1997. BDV can infect a variety of warm-blooded animals and cause a persistent infection in the central nervous system of infected animals, which can lead to neuropathological disease. Reverse genetic systems have proved that they are a very useful tools to analyze the viral life cycle, the regulatory function of viral proteins and molecular mechanisms of viral pathogenicity. Scientists have done a lot of research on reverse genetic systems for human influenza virus, but less on AIV. BDV is still a mysterious virus, about which there are many open questions that are not answered. In this study I tried to establish a reverse genetic system for the avian influenza virus A/Goose/Guangdong/1/96 (H5N1) and for BDV, respectively.In the first part of my work, eight Pol I plasmids including the complete cDNAs of the eight segments of the A/Goose/Guangdong/1/96 (H5N1) have been constructed to establish a reverse genetic system for the A/Goose/Guangdong/1/96 (H5N1). As the biological safety has to be considered, I tried to rescue reassortant viruses using the genes of the strain A/FPV/Rostock/34 (H7N1) (FPV) as a genetic background with only one gene of A/Goose/Guangdong/1/96 (H5N1) in order to test that every plasmid with a complete cDNA of the strain A/Goose/Guangdong/1/96 (H5N1) virus is functional. At least five plasmids were proved to be functional either by a direct (CAT-assay) or indirect (generation of a reassortant virus) method. The rescued reassortant GD1NSFPV virus, that carries the A/Goose/Guangdong/1/96 (H5N1) NS gene and the other 7 genes of FPV, differs in its growth characteristics significantly from the wild type virus FPV. In order to analyze why the reassortant GD1NSFPV is different from the wild type FPV, I investigated the induction of the Raf/MEK/ERK cascade with both viruses, as this cascade is important for the formation of infectious virus. Also I compared the NS1 protein of both viruses, as it is a major viral factor for the pathogenicity and replication efficiency of influenza A viruses. The results showed that there are no big differences in the activation Raf/MEK/ERK cascade between both viruses, which therefore can not be an important reason for the different growth characteristics of both viruses. With the help of two protein domains, the NS1 protein exerts its proviral functions in part by binding free RNA (dsRNA/mRNA) thereby preventing the activation of cellular defense mechanisms and reducing the translation efficiency of cellular mRNAs for the benefit of viral replication. The amino acids sequence of the NS1 protein of GD1NSFPV differs from that of FPV, specially in the RNA binding domain and in the effector domain. Moreover the differences in the RNA binding domain and the effector domain of both NS1 proteins result in a difference of hydrophilicity of both proteins. Furthermore the reassortant GDNS1FPV virus more effectively prevented the cellular interferon expression, which is an important initial step to establish cellular/innate immunity. Nevertheless the key element that leads to the different growth characteristics of both viruses remains to be determined. The studies about the pathogenicity of the reassortant GD1NSFPV virus will be performed by animal experiments in future work in China. In the second part, according to new data for the BDV genomic 5'- and 3'-ends (the existence of an additional 'A' residue at the extreme 3'-end of the single-strand genomic RNA of BDV and a 'U' residue probably to be found at the 5'-end), I have generated Pol I expression constructs expressing a reporter transcript (CAT gene). They start with a hammerhead ribozyme sequence beginning with an 'A' residue, because the RNA polymerase I normally does not incorporate an 'U' as the first residue. I could show that the hammerhead ribozyme cleaves the transcript in vitro in cis to generate a new 5'-end that starts with the genomic 'U' residue, and that the correct 3'-end of the transcript is generated by a hepatitis delta virus (HDV) ribozyme that also cleaves the transcript in cis. Moreover I was able to show that the correct 3'- and 5'-ends of the mini-genome were also generated by the two ribozymes in vivo, and that the BDV polymerase can use the antigenomic mini-transcript for replication and transcription in a BDV-dependent system. Furthermore the RPA results indicate that the putative polyadenylation signal in the 3'-non coding region (NCR) is indeed used by the viral polymerase. I also showed that the mini-transcript generated by the Pol I expression construct is functional in a plasmid-based reverse genetic system, and I could confirm published results demonstrating that this process depends on the delicate ratio of the viral N and P proteins.As AIVs of the H5N1 type are of major important for poultry production, my work will help to provide the basis for future work on the pathogenicity of these viruses and could lead to designed immunogens for vaccination. Specially an analysis of the differences in the pathogenicity between the reassortant GDNS1FPV and the wild type FPV will help to elucidate the specific role of the viral NS1 protein for the viral replication cycle. Even though two reverse genetic systems for BDV have been published during the completion of my work on an according system, my mini-genome differs in the specific nucleotide sequence of the cis-active NCRs. As these are important for BDV-genome replication and transcription, it was important to show that the predicted NCR-sequences are functional. My work could therefore be a basis for improved reverse genetic systems for both viruses and might help us to understand the character of these viruses.