Modification of proteins and low molecular weight substances with hydroxyethyl starch (HES)

Abstract

Polymer conjugation attracts increasing interest in pharmaceutical industry for delivering drugs of simple structure as well as complex compounds such as oligonucleotides, peptides and proteins. However, by far the most active research field is peptide and protein conjugation, mainly because they are therapeutically interesting compounds with very unsatisfactory pharmacokinetics (e.g., low stability, solubility problems, immunogenicity and low residence time in the body). The objective of this work was to develop a new conjugation technology, which might be able to overcome some of these limitations. This technology uses hydroxyethyl starch, a highly biocompatible semi-synthetic polysaccharide, as a polymeric carrier. Our experiments demonstrated the feasibility of a covalent coupling between polymer and protein with two different coupling strategies yielding amide (approach A) and amine bonds (approach B), respectively. The protein chosen as a model for the optimisation phase was human serum albumin. As prerequisite for the desired selective coupling according to approach A, the polysaccharide previously needs to undergo a selective oxidation process. Two different selective oxidation methods were optimised to obtain in high yield one unique carboxylic function per polymer chain. The coupling of the oxidised polymer to HSA according to approach A resulted in yields greater that 90%. Approach B uses the polymer as such and the coupling exploits a Schiff s base reaction in presence of a selective reducing agent. This strategy gave yields around 40-50%. Both these reactions were carried out with polymer chains of different size in the range of 10 130 kD. Besides the chemical feasibility of these new conjugation reactions, it was moreover shown, by using a model enzyme (superoxide dismutase) as target protein, that it is possible to obtain a conjugate which still completely retains the functionality of the original protein after the chemical modification. Furthermore the conjugates seem to have a much lower reactivity towards antibodies than the original proteins, as shown by a double immunodiffusion testsystem. Probably the polymer chains mask some antigenic epitops by sterically hindering the accessibility of the protein surface. The coupling technology was furthermore adapted to the conjugation of drugs with low molecular weight, which present administration limits due to their pharmacokinetics. In this case a cleaner coupling strategy was exploited. The selectively oxidised polysaccharide was obtained in the lacton form by simply eliminating a water molecule. The lacton being a reactive form of the carboxylic acid, yielded a stable covalent bond without the need of any other reagent than the polymer and an amino function of the the drug itself. The conjugation was performed with Amphotericin B, an antifungal drug which is very effective but presents solubility problems that turn out to be the origin of many side effects. The hydroxyethyl starch-Amphotericin B conjugate, besides keeping intact the whole antimycotic potential of the drug, was found to increase the water solubility almost 1000-fold and showed evidences of a better selectivity in distinguishing the pathogen from the host. Moreover, the conjugate showed an unexpected stability in solution. After 90 days at room temperature the antimycotic potential was still the same compared to the original, non-modified drug. Since this new technology is of considerable commercial interest, the data obtained in this work have lead to two patent applications: WO03074087 Coupling of proteins to a modified polysaccharide;WO03074088 Coupling of low-molecular weight substances to a modified polysaccharide. Polymerkonjugate sind für die pharmazeutische Industrie von erheblichem Interesse, da sie sich für das 'Drug delivery' von niedermolekularen Substanzen, aber auch von komplexeren Verbindungen wie Oligonukleotiden, Peptiden oder Proteinen einsetzen lassen.Der Schwerpunkt der Forschungsarbeiten liegt dabei auf der Modifizierung von Peptiden und Proteinen. Hauptgrund hierfür ist, dass diese aus therapeutischer Sicht zwar hochinteressant sind, aber auf Grund ihrer häufig unbefriedigenden pharmakokinetischen Eigenschaften wie geringe Stabilität, geringe Löslichkeit, immunogene Wirkung und geringe in vivo-Verweilzeiten Probleme in der klinischen Anwendung mit sich bringen. Das Thema dieser Arbeit war die Entwicklung einer neuen Kopplungstechnologie, mit Hilfe derer ein Großteil der oben erwähnten Probleme gelöst werden könnte. Dazu wurde Hydroxyethylstärke, ein optimal biokompatibles, semi-synthetisches Polysaccharid als Konjugationspartner ausgewählt. Die hier berichteten Experimente zeigen die Machbarkeit einer kovalenten Kopplung zwischen dem Polymer und einem Protein mit zwei unterschiedlichen Kopplungsstrategien, die entweder zu einer Amidbindung (Strategie A) oder zu einer Aminbindung (Strategie B) führten. Als Modellprotein für diese Machbarkeitsstudien wurde humanes Serumalbumin (HSA) eingesetzt. Als Voraussetzung für die geforderte selektive Kopplung nach der Strategie A musste die Hydroxyethylstärke selektiv oxidiert werden. Zwei verschiedene Methoden zur selektiven Oxidation am reduzierenden Ende des Polysaccharids zur Carbonsäure mit sehr hohen Ausbeuten wurden etabliert. Bei der Kopplung des so oxidierten Polymers mit HSA wurden Ausbeuten von > 90% erzielt. Im Alternativansatz B wurde das Polysaccharid unbehandelt eingesetzt und eine Kopplung über eine Schiff-Basen-Reaktion in Gegenwart eines selektiv reduzierenden Reagens erreicht. Mit dieser Strategie wurden Kopplungsausbeuten von 40-50% beobachtet. Beide Reaktionswege wurden mit Polysacchariden unterschiedlicher molarer Masse im Bereich von 10 bis 130 kD durchgeführt. Mit einem zweiten Modellprotein, dem Enzym Superoxiddismutase (SOD) konnte zudem gezeigt werden, dass die biologische Aktivität des Enzyms im konjugierten Zustand komplett erhalten wurde. In Doppel-Immundiffusionstests konnte gezeigt werden, dass die HES-Protein Konjugate anscheinend eine geringere Reaktivität gegen Antikörper haben, welche das unmodifizierte Protein mit hoher Affinität binden. Wahrscheinlich maskieren die Polymerketten durch sterische Hinderung antigene Epitope auf dem Zielprotein, so dass die Bindung der Antikörper erschwert wird. Die HES-Kopplungstechnolgie konnte weiterhin für die Konjugation von niedermolekularen Wirkstoffen adaptiert werden, deren breite klinische Anwendung durch pharmakokinetische oder toxische Probleme limitiert ist. Für die Modifizierung dieser Stoffe wurde eine elegante Methode gefunden, die ohne Aktivierungsreagentien auskommt. Das selektiv oxidierte Polysaccharid wird dabei durch Elimination eines Wassers in die Lactonform überführt. Die Lactonform stellt in wasserfreien Medien eine aktivierte Form der Carbonsäure dar, die in der Lage ist, mit einer Aminogruppe im Sinne einer Aminolyse zur stabilen Amidbindung zu reagieren. Die beschriebene Reaktion wurde mit Amphotericin B (AmphoB) durchgeführt, ein sehr effektives Antimykotikum, das jedoch eine sehr geringe Wasserlöslichkeit besitzt, die als Ursache für zahlreiche, zum Teil schwere Nebenwirkungen wie Nieren- und Lebertoxizität angesehen werden. Das AmphoB-HES-Konjugat behält seine volle antimykotische Wirksamkeit und weist zudem eine, im Vergleich zum unmodifizierten AmphoB mehr als 1000-fach höhere Wasserlöslichkeit auf. Des weiteren gibt es Hinweise auf eine erhöhte Selektivität des Konjugats gegenüber Pilzmembranen im Vergleich zu Membranen der Wirtszelle. Das Konjugat wies eine unerwartet hohe thermische Stabilität auf. Bei Lagerung als wässrige Lösung unter Raumtemperaturbedingungen wurde nach mehr als 90 Tagen keine Abnahme der antimykotischen Aktivität gefunden. Da diese neue Technologie von bedeutendem kommerziellen Interesse ist, wurden mit den in dieser Arbeit gewonnen Daten zwei Patentanmeldungen eingereicht, die Schutzrechte für die Kopplung in wässriger Phase und die Aminolyse des HES-Lactons in wasserfreien Medien erwirken sollen:WO03074087 Kopplung von Proteinen an ein modifiziertes Polysaccharid;WO03074088 Kopplung niedermolekularer Substanzen an ein modifiziertes Polysaccharid.