Einfluss von Entzündungsmediatoren und reaktiven Oxidantien auf die transepitheliale Natriumresorption der Lunge

Abstract

Die Lunge von Xenopus laevis bietet aufgrund der anatomischen Einfachheit exzellente Voraussetzungen zur Charakterisierung transepithelialer Ströme in der Ussing-Kammer. Darüber hinaus bedingt die funktionelle Ähnlichkeit bezüglich der natriumabhängigen Resorptionsleistung von Lungenepithelzellen aus Xenopus und ATI- sowie ATII-Zellen der Säugerlunge die Möglichkeit zur Bearbeitung komplexer Fragestellungen von Transportprozessen am einfachen Modell der Froschlunge. Im Mittelpunkt der Arbeit stand die Beantwortung der Frage, welchen Einfluss Entzündungsmediatoren, die bei Erkrankungen der Lunge freigesetzt werden, auf die Amilorid-sensitive Natriumresorption des Lungenepithels haben. Es konnte gezeigt werden, dass apikal appliziertes PGE2 (1 µM) den transepithelialen Strom über das Lungenepithel von X. laevis stimuliert. Diese Stimulation ist vollständig durch Amilorid hemmbar, was auf eine PGE2-induzierte Aktivierung der apikal lokalisierten ENaCs zurückzuführen ist. Der Ki-Wert dieser Stimulation beträgt 32,2 nM. Forskolin, ein Aktivator der Adenylatzyklase, ist in der Lage einen vergleichbaren Effekt auf ISC und Iami hervorzurufen. Der PKA-Inhibitor RP-cAMP (RP-Isomer des cAMP) unterbindet sowohl die durch PGE2 als auch die durch Forskolin induzierte Stimulation von ISC und Iami. Diese wird zudem von Bapta/AM, einem membrangängiger Calciumchelator, inhibiert. Aufgrund dessen konnte gezeigt werden, dass PGE2 den Iami über cAMP-abhängige, aber ebenso über Ca2+-abhängige Signaltransduktionsketten stimuliert. Man kennt vier verschiedene PGE2-Rezeptoren (EP1-EP4). EP2- und EP4-Rezeptoren erhöhen die intrazelluläre cAMP-Konzentration, wohingegen EP1- und EP3-Rezeptoren die Calciumkonzentration im Cytosol erhöhen. Einen Sonderfall stellen EP3-Rezeptoren dar, die sowohl über die Modulierung der cAMP-Konzentration als auch die Erhöhung der intrazellulären Calciumkonzentration zelluläre Antworten regulieren können. Durch Applikation der Rezeptoragonisten Sulproston (EP1/3), Misoprostol (EP2/3) und PGI2 (EP1), wobei erstere ISC und Iami stimulierten, konnte gezeigt werden, dass PGE2 wahrscheinlich an apikale EP3-Rezeptoren bindet und somit eine Signalkaskade startet, welche die Steigerung der Natriumaufnahme der Xenopus-Lunge verursacht.In Versuchsansätzen mit NO wurde kein Einfluss auf den ISC der Xenopus Lunge nachgewiesen. Im Modell der Xenopus Oocyte bewirkten im Gegensatz dazu NO und Peroxynitrit die Verminderung des Iami nur bei solchen ENaCs, deren a-Untereinheiten von der Lunge des Mensch oder Meerschweinchens stammten. Der Effekt wird aber im Gegensatz zu dem für NO typischen Signaltransduktionsweges nicht über cGMP vermittelt. Darüber hinaus wurde der Einfluss diverser cAMP- und cGMP-Derivate auf den Iami verschiedener in Xenopus Oocyten heterolog exprimierter ENaCs untersucht. Dabei zeigten sich unterschiedliche Effekte, welche eine klare Abhängigkeit vom Substituenten der cyclischen Nucleosinmonophosphate wiederspiegelten. Während der Iami des xENaC infolge der cpt-Derivate nicht verändert wurde, bewirkten diese bei gplα/rβγ ENaC und hlENaC exprimierenden Oocyten eine starke Stimulation des Amilorid-sensitiven Stroms. Anders verhielt es sich bei den 8-bromo substituierten second messengern. Diese stimulierten den Iami in xENaC exprimierenden Oocyten, hatten aber keinen Einfluss auf gplα/rβγ ENaC abhängige Natriumströme. Diese Effekte beruhten allerdings wahrscheinlich nicht auf Phosphorylierungen der ENaCs durch die cAMP-abhängigen Kinasen, sondern auf noch näher zu charakterisierenden direkt am ENaC in der Oocytenmembran oder an assoziierten Proteinen ansetzenden Regulationsmechanismen. Xenopus laevis lung epithelium is like the mammalian lung epithelium a sodium absorbing tissue with a high transepithelial resistance. This amphibian epithelium is covered with alveolar surface liquid (ASL) that consists of layers of pericilliary fluid, mucus and surfactant. The ASL is important for physiological functions as gas exchange but also contains various para- and autocrinely released messengers that e.g. mediate inflammatory responses to inhaled irritants. The viscosity of the ASL depends largely on water flow that passively follows transepithelial sodium and chloride-transport. Water absorption is primarily coupled to sodium uptake by the epithelial cells via apically localized amiloride-sensitive sodium-channels (ENaCs) and the basolateral Na+/K+-ATPases. This study investigated the regulating influence of inflammatory factors on the transcellular ENaC-mediated sodium uptake in native Xenopus laevis lung. For the electrophysiological characterization of the Xenopus lung transepithelial currents the Ussing-chamber-technique was used. In Xenopus laevis native lung epithelium, apical application of 1 µM PGE2, an inflammatory mediator produced either by epithelial cells or alveolar macrophages increased short-circuit current (ISC) about 40 % and the amiloride-sensitive sodium current (Iami) about 60 % whereas e.g. PGI2 had no effect. Chloride-free conditions only slightly affected the increase in current by PGE2 indicating that the additional current is carried by Na ions. Forskolin, an activator of adenylate-cyclases, enhanced ISC and Iami to a similar magnitude. This suggests that PGE2 acts on lung epithelial cells by a cAMP-mediated regulatory mechansism. This hypothesis is supported by the fact that RP-cAMP, an inhibitor of proteinkinase A (PKA), suppressed the PGE2-induced effect on ISC and Iami. Further, cytosolic free Ca2+-ions seem to be as well involved in mediating the PGE2-effect because an intracellular accumulation of the calcium-chelator Bapta/AM prevented the PGE2-induced stimulation of the current. Prostaglandins bind to four different types of G-protein coupled receptors: the EP1 EP4. Both, the EP1/3 agonist sulprostone and the EP2/3 specific agonist misoprostol increased Iami in a significant way. These findings indicate, that in the Xenopus lung epithelium PGE2 binds to apical EP3-receptors and upregulates amiloride-sensitive Na+-transport by cAMP and Ca2+-dependent mechanisms.