DNA-Bindung und -Spaltung durch den DNA-Fragmentierungs-Faktor (DFF)

Abstract

Der DNA-Fragmentierungs-Faktor(DFF)spielt eine wesentliche Rolle bei der DNA-Fragmentierung im Zuge der Apoptose. Er besteht aus den beiden Unter-einheiten DFF40 (CAD) und DFF45 (ICAD), wobei erstgenannte nukleolytische Funktion ausübt und DFF45 (ICAD) spezifischer Faltungshelfer und Inhibitor der Nuklease ist. Im ersten Teil der Arbeit wird ein Expressions- und Reinigungssystem für DFF vorgestellt. Mit dem Zwei-Plasmid-Expressions-System pACET-DFF45/ pET-DUET-His-CAD wurde DFF rekombinant in hohen Mengen in E. coli produziert. Der affinitätschromatographischen Reinigung über Ni-NTA-Agarose folgte ein zweiter Reinigungsschritt zur Entfernung von Proteinkontaminationen und chromosomaler Bakterien-DNA über Anionen- austauschchromatographie. Über Ultrafiltrationseinheiten konzentriert wurde aus 10 l Fermentern ca. 50 mg DFF präpariert. Dieser Komplex wurde für biochemische Studien, z. B. der Untersuchung der DNA-Bindung von DFF, und auch in strukturellen Untersuchungen eingesetzt. Ein Ziel dieser Arbeit lag in der biochemischen Charakterisierung des aktiven Zentrums von DFF40 (CAD). Zur Identifizierung katalytisch relevanter Aminosäurereste trug die ortsgerichtete Mutagenese bei. Für Histidinreste und Lysinreste konnte in der vorliegenden Arbeit einefunktionelle Relevanz ermittelt werden, was durch chemische Modifizierungsexperimente unterstützt wurde (Meiss et al., 2001, Korn et al., 2002). Eine eindeutige funktionelle Zuordnung gelang für His263 als allgemeine Base im Mechanismus der Phosphodiesterspaltung. Für His308 wurde über eine Rolle als allgemeine Säure spekuliert (Meiss et al., 2001, Korn et al., 2002). Die tatsächliche Funktion als wichtigster Rest für die Koordination des zweiwertigen Metallions Mg2+ konnte für His308 nach einem Alignment mit ColE9 DNase und T4 Endonuklease VII und weiteren Mutationsanalysen später nach dem Erhalt von Strukturinformationenzugeordnet werden. Mit diesen Informationen, experimentell bewiesen, konnte CAD der Superfamilie der ββα-Me-finger-Nukleasen zugeordnet werden, ein Modell des aktiven Zentrums der Nuklease aufgestellt und der Mechanismus der Phosphodiesterspaltung dargestellt werden (Scholz et al., 2003). Mit dem getrennt induzierbaren Expressionssystem pLK-HisFlag-ICAD-S/ pGEX2T-CADWT war eine getrennte Induktion der Expression der beiden Gene ICAD-S und GST-CADWT in E. coli zu erreichen. Der Komplex aus GST-CAD/ ICAD-S wurde anschließend affinitätschromatographisch gereinigt und zur Untersuchung der chaperonen Aktitvität von ICAD-S eingesetzt. Die aus diesem Komplex mittels Caspase-3 freigesetzte Nuklease zeigte in DNA-Spaltexperimenten eine nukleolytische Aktivität, wodurch die chaperone Eigenschaft von ICAD-S nachgewiesen werden konnte. Gegenüber ICAD-L ist die chaperone Aktivität der kürzeren Splicevariante allerdings etwa 50 mal weniger effektiv (Scholz et al., 2002). Der Nachweis der DNA-Bindung ist bei unspezifischen Nukleasen und DNase/Inhibitor-Komplexen sehr ungewöhnlich. Im Laufe dieser Arbeit konnte mit DFF sowohl für den Komplex als auch für die aktivierte Nuklease DFF40 (CAD) DNA-Bindung gezeigt werden. DNA-Bindung von DFF stellt einen neuen, bislang unbekannten Mechanismus der Nukleaseinhibition dar, bei dem zwar die DNA-Spaltung verhindert, aber die DNA-Bindung zugelassen wird. Außerdem wurde eine Stimulation der Aktivität von DFF40 (CAD) durch Aktivierungaus einem DNA-gebundenen DFF-Komplex mit Plasmid-DNA und auch mit isolierten Kernen festgestellt. Diese Tatsache und die beobachtete Assoziation von DFF mit Chromatin implizieren einen Mechanismus, bei dem die Aktivierung von DFF während der Apoptose im Zellkern in DNA-gebundener Form stattfinden kann (Korn und Scholz et al., 2005).