Struktur, Lokalisation/Regulation und Interaktionspartner der Dam-Methyltransferase aus Escherichia coli

Abstract

Die Dam-MTase aus E.coli ist eine N6-Methyltransferase. Sie katalysiert den Methylgruppentransfer von SAM auf das Adenin an der N6-Position innerhalb der Erkennungssequenz GATC in einer prozessiven Reaktion. Die Zielbase wird dabei um 180° aus der DNA-Doppelhelix herausgedreht. Das natürliche Substrat des Enzyms ist hemimethylierte DNA, die kurz nach der Replikation vorliegt, da der neusynthetisierte Tochterstrang noch nicht methyliert ist. Die Dam-MTase in E.coli ist nicht essentiell, dennoch übernimmt sie wichtige Aufgaben. Ist das dam-MTase Gen mutiert führt das zu einer erhöhten Zahl an Einzelstrangbrüchen, erhöhte Mutationsraten, Hyperrekombination, eine verstärkte Anfälligkeit gegenüber DNA-schädigenden Faktoren und Störungen innerhalb vieler Stoffwechselwege, wie dem Energie-, Aminosäure- und Nukleotidstoffwechsel. Die Dam-MTase ist eine solitäre MTase, welche nicht mit einem Restriktionsenzym in einem R/M-System assoziiert ist. Sie ist beteiligt an der Regulation vieler Gene. Einige Promotoren werden nur im vollmethylierten Zustand, andere nur im hemimethylierten Zustand abgelesen. Außerdem synchronisiert sie die Replikation mit dem Zellzyklus und spielt eine Rolle in der Segregation der Chromosomen und in der post replikativen mismatch Reparatur.In dieser Arbeit wurde zunächst versucht die 3D-Struktur dieses Proteins zu lösen. Um eine genaue Kenntnis über das Erkennen der Zielsequenz, der Kofaktorbindung und den Mechanismus des Methylgruppentransfers zu erhalten, sollte mit Hilfe der NMR-Spektroskopie die Struktur gelöst werden. Dazu wurde die Aufreinigung des Proteins so weit optimiert, dass hochreines, hochkonzentriertes Protein in hohen Volumina in 300 mM Na-Phosphatpuffer pH6 und 100 µM SAM erhalten wurde, welches bei 20°C stabil vorlag, bei 37°C jedoch nicht. Eine 15N-Markierung des Proteins war erfolgreich durchgeführt worden. Da die NMR-Messungen bei 37°C durchgeführt werden müssten und alle Versuche, das Protein bei dieser Temperatur mit den für die NMR-Spektroskopie nötigen Vorraussetzungen, stabil zu halten, fehlschlug, konnte die Struktur der Dam-MTase in dieser Arbeit nicht gelöst werden. Um die Koordination der Repliaktion mit der post repliaktiven mismatch Reparatur und der Remethylierung zu untersuchen wurde zum einen mit verschiedenen Methoden nach Interaktionspartnern der Dam-MTase gesucht und zum anderen die intrazelluläre Lokalisation des Enzyms mit Hilfe eines damGFP-Fusionsproteins untersucht. Durch far western Analysen konnten 17 Interaktionspartner der Dam-MTase gefunden werden, wovon 11 durch MALDI-TOF MS und ESI MS identifiziert werden konnten. Um die Interaktion zu verifizieren, sollten diese durch biochemische Methoden weiter untersucht werden. Dazu wurden die Gene für diese Proteine als GST-Fusionen kloniert und aufgereingt. Dies gelang mit 10 der Interaktionspartner. Anschließend wurden Interaktionsassays mit der Dam-MTase durchgeführt. Die Interaktion konnte für sieben Proteine (Pyruvat-Kinase, & #945;-Untereinheit der ATP-Synthase, Serin-Hydroxymethyltransferase, Fruktose-Biphosphat-Aldolase, Elongationsfaktor Tu, Uridin-Phosphorylase und Enolase) verifiziert werden. Es wurden auch Proteine der MMR (MutS und MutH) und der DNA-Replikationsmaschienerie (DNA-Polymerase I und III, Ligase A und B) als GST-Proteine kloniert. Die Inetraktionsassays mit diesen Proteinen sollen folgen.Bei der Untersuchung der Intrazellulären Lokalisation zeigte sich eine polare Lokalisation des damGFP-Fusionsproteins, welches in vivo und in vitro aktiv und stabil ist. Das GFP-Protein alleine zeigte diese polare Lokalisation nicht, ebenso wie eine methylierungsinaktive Variante des damGFP-Fusionsproteins Dam(APPY)GFP. Daraus kann man schlussfolgern, dass die Lokalisation mit der Methylierungsfunktion verbunden ist. Das DamGFP-Fusionsprotein kolokalisiert nicht mit der DNA. Durch Experimente mit Aztreonam behandelten Zellen konnte gezeigt werden, dass das methylierungsaktive Fusionsprotein an potentiellen Zellteilungsstellen lokalisiert, während die methylierungsinaktive Variante eine Fluoreszenz in der gesamten Zelle aufweist. Mit Hilfe von time lapse Experimenten und Kolokalisationsstudien mit den Interaktionspartnern, die in der far western Analyse identifiziert wurden, soll in der Zukunft diese Lokalisation näher untersucht werden.