Molekularbiologische Charakterisierung der Forisome

Abstract

In der vorliegenden Arbeit wurden erste Erkenntnisse zum molekularen Aufbau phloemspezifischer Strukturproteine der Familie der Fabaceen beschrieben. Diese, als Forisome bezeichneten Proteine, reagieren auf die Zugabe zweiwertiger Kationen wie Ca2+ und auf Veränderungen des pH-Wertes im umgebenden Medium sowohl in vivo als auch in vitro mit einer Konformationsänderung von einem spindelförmigen, kondensierten in einen abgerundeten, dispergierten Zustand. Die Aufreinigung der Proteinkomplexe aus Vicia faba und Canavalia gladiata ermöglichte die Generierung von Peptidsequenzen einzelner Untereinheiten der Forisome, auf deren Basis die Klonierung der Forisomen-Gene mfor_1-3von Medicago truncatula erfolgte. Dies ermöglichte die Herstellung rekombinanter Proteine und polyklonaler Antiseren, wodurch ein eindeutiger Nachweis der Zugehörigkeit der durch mfor_1-3 kodierten Proteine zu den Forisomen erbracht werden konnte. Die Aktivität der korrespondierenden Promotoren konnte ausschließlich im Phloem transgener Pflanzen lokalisiert werden dem natürlichen Bildungsort der Forisome. Unter Verwendung dieser experimentellen Daten konnte schließlich ein vorläufiges Modell zur Kalzium-Reaktivität derForisome entwickelt werden. Die Optimierung der SDS-PAGEs aufgereinigter, denaturierter Forisome resultierte in der Auftrennung dreier Proteine mit Molekulargewichten von ca. 70 kDa, allerdings erst nach Zugabe von Ca2+ ins SDS-PAA-Gel. Die Veränderung des Laufverhaltens einer Untereinheit, möglicherweise aufgrund einer Ca2+-induzierten Konformationsänderung des Proteins, gewährleistet die optische Trennung der drei Banden bei ca. 70 kDa. Des Weiteren lässt das Bandenmuster der hochmolekularen Proteine auf die Di- bzw. Multimerisierung der Untereinheiten schließen. Der Abgleich von generierten Peptidsequenzen der 70 kDa großenProteine der V. faba-Forisome mit öffentlich zugänglichen Datenbanken ermöglichte die Klonierung der Forisomen-Gene mfor_1, mfor_2 und mfor_3. Sequenzanalysen zeigen, dass es sich bei den Forisomen-Genen um eine neue Genfamilie handelt, deren Mitglieder eine ca. 60%ige Homologie untereinander aufweisen, allerdings keine signifikanten Homologien zu bereits publizierten Sequenzen zeigen. Die rekombinante Herstellung der drei Forisomen-Proteine MFOR_1, MFOR_2 undMFOR_3 im bakteriellen System ermöglichte die Produktion der polyklonalen Antikörper anti-MFOR_1 und anti-MFOR_2. Bedingt durch die lediglich geringe Expression von MFOR_3 im bakteriellen System, stand für diese Untereinheit kein Antiserum zur Verfügung. Daher wurde die 70 kDa-Untereinheit von V. faba und C. gladiata für die Immunisierung von Mäusen eingesetzt. Die Detektion von rekombinant hergestellten MFOR_3 durch die anti-vf- und anti-can-Antikörper ermöglichte die Zuordnung der Untereinheit MFOR_3 zu den Forisomen. Darüber hinaus konnten mit Hilfe der Antikörper der rekombinanten Untereinheiten MFOR_1 und MFOR_2 sowohl Proteine der über SDS-PAGE aufgereinigten Forisome als auch native Forisome detektiert werden. So wurde für alle drei rekombinanthergestellten Proteine der Nachweis erbracht, dass sie am Aufbau der Forisome beteiligt sind. Nach Klonierung der drei Forisomen-Promotoren prom/mfor_1, prom/mfor_2 undprom/mfor_3 konnte ihre Aktivität in Tabakprotoplasten nachgewiesen werden. DieVerortung der Promotoraktivität hinsichtlich der Frage nach dem Bildungsort der Forisome erfolgte durch die Verwendung des Reporterenzyms ß-Glukuronidase. Die stabile Integration der Promotor-GUS-Konstrukte ins Tabakgenom und die Regeneration transgener Pflanzen zeigte die Phloemspezifität aller drei Promotoren. Keine der drei Forisomen-Untereinheiten zeigte nach Sequenzanalyse ein bekanntes Ca2+-Bindungsmotiv. Allerdings konnte für die Untereinheit MFOR_2 eine coiled coil Domäne identifiziert und damit die Ausbildung einer amphipatischen a-Helix nachgewiesen werden. Eine sorgfältige Analyse aller Experimente bezüglich der physiologischen und molekularen Daten der Forisome erlaubte den Entwurf eines Modells zur Erklärung der Konformationsänderung der Proteinkomplexe. Grundlage dieses Modells bildet die hydrophobe Interaktion der coiled coil Domänen, die damit einhergehende Oligomerisierung der Untereinheit MFOR_2 und die durch Neutralisierung geladener Aminosäuren induzierte Umfaltung der coiled coil Struktur. Mit Hilfe dieses Modells ist sowohl die a2+-induzierteals auch die pH-abhängige Konformationsänderung der Forisome erklärbar.