Verstärkung der Translation stromaufwärts gelegener Reportergene durch interne Ribosomen-Eintrittsstellen von Picornaviren

Abstract

In der vorliegenden Arbeit wurde festgestellt, dass die internen Ribosomen-Eintrittsstellen (IRES) von Picornaviren die Translation nicht nur des stromabwärts gelegenen Gens fördern, sondern auch die Translation eines stromaufwärts der IRES gelegenen Gens verstärken können. Die Kenntnis dieses Effektes hat Auswirkungen auf die Interpretation der Ergebnisse von Replikations- und Translationsstudien mit dicistronischen Replikonsystem und das Design viraler Replikonsysteme. Die meisten zellulären mRNAs werden cap-abhängig translatiert. Dabei bindet der aus den eukaryotischen Initiationsfaktoren eIF4E, eIF4G und eIF4A bestehende Cap-Bindungs-Komplex eIF4F an das Cap-Nukleotid am 5' Ende der mRNA und bewirkt zusammen mit anderen Initiationsfaktoren die Bindung der kleinen ribosomalen Untereinheit an die mRNA. Bei einigen viralen und zellulären RNAs erfolgt dieser Vorgang dagegen Cap-unabhängig an einer internen Ribosomen-Eintrittsstelle (IRES). Die IRES-Elemente der Picornaviren benötigen dafür alle eukaryotischen Initiationsfaktoren außer dem Cap-bindenden Protein eIF4E. Andere IRES-Elemente, wie das von Hepatitis C Virus (HCV), benötigen dafür außer eIF3 keine weiteren Initiationsfaktoren. Picornavirale IRES-Elemente werden vor allem in viralen Replikonsystemen, aber auch in dicistronischen (oder multicistronischen) Vektoren in der Gentherapie oder zur Analyse der Funktion der IRES-Elemente selbst verwendet. In solchen Vektoren wird oft die Expression des ersten, vor der IRES gelegenen Reportergens als interne Kontrolle verwendet, mit deren Hilfe die Expression des zur Messung der IRES-Aktivität verwendeten zweiten, stromabwärts der IRES gelegenen Reportergens standardisiert wird.Während Reportergene in dicistronischen Vektoren mit einer Picornavirus-IRES bis zu einer Salzkonzentration von 120 mM K+ optimal translatiert werden, werden Gene in einer monocistronischen mRNA meist nur bei Salzkonzentrationen bis etwa 90 mM K+ optimal translatiert. Werden diese Gene allerdings in einem dicistronischen Konstrukt vor einer Picornavirus-IRES eingefügt, werden auch sie bei höheren K+-Konzentrationen bis etwa 120 mM effizient translatiert. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass diese Verstärkung der Translation unabhängig von der Natur des ersten Reportergens und von der Translation des zweiten, stromabwärts gelegenen Reportergens ist. Dieser Verstärkungseffekt erfolgt in cis und er tritt nicht bei Verwendung einer HCV-IRES auf. Bei Verwendung einer mutierten Picornavirus-IRES, die zwar noch die Bindungsstelle für eIF4G, aber keine IRES-Aktivität mehr aufweist, wird die Translation des stromaufwärts gelegenen Reporters noch effizient verstärkt. Der Effekt der Translations-Verstärkung wird durch kompetierendes Cap-Nukleotid gehemmt, was zeigt, dass eIF4F der entscheidend an diesem Vorgang beteiligte Faktor ist. Auch nachdem eIF4G mittels einer picornaviralen Protease gespalten wurde, konnte der erste Reporter noch effizient translatiert werden, das C-terminale Fragment von eIF4G ist also für die Verstärkung der Translation des ersten Reporters ausreichend. Diese Daten lassen den Schluss zu, dass der eIF4F-Komplex, der an ein picornavirales IRES-Element in einer dicistronischen RNA über das eIF4G-Protein gebunden hat, in cis an das 5'-Ende der RNA weitergereicht werden kann, wo er entweder durch eIF4E an das Cap-Nukleotid oder wiederum über eIF4G an die RNA bindet und dann die Translation stimuliert. The internal ribosome entry site (IRES) elements of picornaviruses not only drive the translation of downstream reportergens but also may stimulate the translation of a gene placed upstream of the IRES. This knowledge is important for the interpretation of results obtained with such dicistronic constructs and for the design of viral replicons. Most mRNAs are translated in a cap-dependent manner. The initiation factor complex eIF4F, consisting of the eukaryotic initiation factors eIF4E, eIF4G and eIF4A, binds to the cap nucleotide at the 5'-end of the mRNA. Together with other eukaryotic initiation factors this interaction guides the small ribosomal subunit to the 5'-end of the mRNA. The resulting pre-initiation complex then scans the mRNA for the start codon. Once the start codon is reached, the large ribosomal subunit binds and translation commences.Certain viral and cellular RNAs initiate translation cap-independently at IRES elements. To initiate translation, picornavirus IRES elements require all canonical eukaryotic initiation factors (except the cap-binding protein eIF4E). Other viral IRES elements like the Hepatitis C virus (HCV) IRES can bind to the small ribosomal subunit in the absence of virtually all translation initiation factors except for eIF3. Picornaviral IRES elements are used in viral replicon systems and dicistronic (or multicistronic) vectors, in gene therapy or to investigate the activity of a given IRES element and its mutant variants. When using such dicistronic constructs, the translation efficiency of the second reporter gene located downstream of the IRES serves as a measure for the activity of the IRES element, whereas the translation of the first reporter gene is usually used for normalization. While reporter genes in dicistronic constructs are well translated at salt concentrations up to 120 mM K+, reporter genes in a monocistronic mRNA are translated well only at salt concentrations up to 90 mM K+. When placed in a dicistronic construct upstream of an IRES element, these reporter genes are translated efficiently at K+ concentrations up to 120 mM.In this study it is shown that internal ribosome entry sites can enhance translation not only of the downstream gene but also of a gene upstream of the IRES at salt concentrations that are comparable to those in living cells. This translation enhancement is independent of the nature of the first reporter and independent of the translation of the second reporter. This effect occurs in cis and was not observed when using the HCV IRES. A mutant picornaviral IRES element still able to bind eIF4G can stimulate the translation of the first reporter gene, and translation of this first reporter still occurs efficiently when eIF4G is cleaved with a picornaviral protease. By using m7GDP, which inhibits binding of the cap-binding eIF4E moiety of translation initiation factor eIF4F to the 5'-terminal cap nucleotide of mRNAs, eIF4F was shown to mediate the translation enhancement. From these findings it is concluded that the eIF4F complex bound to a picornaviral IRES element via its eIF4G moiety can be delivered in cis to the 5'-end of the RNA. eIF4F can then bind to the 5' terminal end of the RNA either by its cap-binding protein eIF4E to the cap nucleotide or by the intrinsic RNA-binding site of eIF4G and stimulate translation.