Human Myostatin : Isolierung aus humaner Skelettmuskulatur, rekombinante Herstellung und Antikörpergenerierung zur Entwicklung und Validierung eines Immunoassays

Abstract

In der vorliegenden Arbeit konnte ein kompetitives Testsystem zur Messung der Myostatinkonzentration in humanem Serum entwickelt werden. Zur Generierung der benötigten Antikörper wurde zunächst versucht, natives Myostatin aus humaner Skelettmuskulatur zu gewinnen. Da die Konzentration an Myostatin in der Muskulatur jedoch relativ gering ist und die verwendeten Antikörper gegen ein Myostatin-Peptid keine ausreichende Spezifität besaßen, wurde zusätzlich dazu rekombinantes Myostatin hergestellt. Für die Entwicklung von rekombinantem Myostatin wurde eine Zelllinie humanen Ursprungs gewählt, damit die posttranslationalen Modifikationen dem nativen Myostatin besonders ähnlich sind. Für die einfache und kostengünstige Aufreinigung des rekombinanten Proteins aus dem Zellkulturüberstand wurde bei der Erstellung des Konstrukts eine Sequenz für einen 6 x His-Tag eingefügt.Nach Immunisierung von Hühnern, Kaninchen und Mäusen mit rekombinantem Myostatin konnten aus diesen Tieren Antikörper gewonnen werden. Die Charakterisierung der Antikörper ergab, dass die polyklonalen IgY-Antikörper aus den Hühnereiern und die polyklonalen IgG-Antikörper aus dem Kaninchenserum rekombinantes Myostatin und alle Untereinheiten und Dimere erkennen. Die monoklonalen IgG-Antikörper, welche durch Fusionierung zu einer Hybridoma-Zelllinie erhalten wurden, erkennen einen Sequenzabschnitt aus der Pro-Domäne von Myostatin. Bei der Verwendung des polyklonalen Kaninchen-Antikörpers auf histologischen Präparaten konnte eine Anfärbung von Muskelzellen erreicht werden. Diese Anfärbung konnte vor allem in der Nähe von Zellkernen und der Plasmamembran verstärkt beobachtet werden. Mit dem verwendeten Antikörper war es möglich, auch in Herzmuskulatur die Zwischenräume der Herzmuskelzellen, also die Glanzstreifen, anzufärben. Aufgrund der gewonnen Erkenntnisse über die Antikörper konnte ein Immunoassay zur Messung von Myostatin entwickelt und erste Validierungen in klinischen Studien durchgeführt werden.