Effect of cAMP/PKA signaling mechanism on barrier function of cultured endothelial cells : role of myosin light chain phosphatase

Abstract

Endothelial barrier dysfunction is often the underlying cause of capillary leakage during pathophysiological conditions like inflammation and ischemia reperfusion. Maneuvers increasing intracellular levels of cAMP protect against imminent failure of endothelial barrier function induced by inflammatory mediators or ischemia-reperfusion. This protective effect is mainly due to an inactivation of the contractile machinery, a primary determinant of endothelial barrier function. The activation of the contractile machinery is regulated by the phosphorylation state of the regulatory myosin light chains (MLC), which is controlled by balanced but antagonistic activities of myosin light chain phosphatase (MLCP) and myosin light chain kinase (MLCK). Here the molecular mechanisms by which cAMP/PKA induced the activation of the MLCP leading to inactivation of the contractile machinery were analyzed. In cultured human umbilical vein endothelial cells activation of adenylyl cyclase by forskolin (FSK) reduced basal macromolecule permeability and caused dephosphorylation of MLC. It also antagonized thrombin-induced increase of both parameters. FSK stimulated the formation of MLCP holoenzyme complex, i.e. it induced the recruitment of the protein phosphatase 1 (PP1) catalytic subunit and myosin phosphatase targeting subunit (MYPT1) to myosin, and activation of the PP1 catalytic subunit. FSK inhibited the RhoA/Rock pathway leading to dephosphorylation of MYPT1. It caused dephosphorylation of the PP1 inhibitory protein CPI-17 at threonine 38 and its detachment from the PP1 catalytic subunit. FSK also blunted the thrombin-induced effect on MYPT1 and CPI-17 phosphorylation. Down regulation of CPI-17 by siRNA attenuated the thrombin effect on endothelial permeability by 35 %. The data of the present study show that stimulation of adenylyl cyclase causes assembly and activation of the MLCP holoenzyme complex and thereby stabilizes endothelial barrier function. Das Versagen der endothelialen Schrankenfunktion ist eine häufige Ursache für die Entstehung eines Capillary leakage im Rahmen einer Entzündung oder Ischämie/Reperfusion. Manöver, die die intrazelluläre cAMP-Konzentration steigern, schützen vor einem drohenden Verlust der Schrankenfunktion. Dieser Schutzeffekt beruht hauptsächlich auf einer Inaktivierung des kontraktilen Apparates, der ein wesentlicher Faktor der endothelialen Schrankfunktion ist. Der Aktivierungszustand des kontraktilen Apparates wird durch den Phosphorylierungsgrad der regulatorischen leichten Kette des Myosins (MLK) geregelt, welche durch die antagonistische Wirkung der MLK-Phosphatase (MLKP) und MLK-Kinase (MLKK) kontrolliert wird. In kultivierten humanen Endothelzellen der Nabelschnurvene reduziert die Aktivierung der Adenylylzyklase durch Forskolin (FSK) die basale Makromolekülpermeabilität und löst eine Dephosphorylierung der MLK aus. FSK antagonisiert auch die Thrombin-induzierte Steigerung beider Parameter. FSK stimuliert die Bildung des MLCP Holoenzymkomplexes, d.h. es induziert die Rekrutierung der Proteinphosphatase (PP1)-Untereinheit und der Myosin-Phosphatase-bindenden Untereinheit (MYPT1) an Myosin und aktiviert die PP1-Untereinheit. FSK hemmt den RhoA/Rock weg, was zu einer Dephosphorylierung von MYPT1 führt. Es induziert die Dephosphorylierung des PP1-inhibitorischen Proteins CPI-17 an Threonin 38 und seine Lösung von der PP1-Untereinheit. FSK vermindert auch die Thrombinwirkung auf die MYPT1 und CPI-17-Phosphorylierung. Die Herunterregulation von CPI-17 durch siRNA verminderte die Thrombin-induzierte Zunahme der endothelialen Permeabilität. Die Daten der vorliegenden Untersuchung zeigen, dass die Stimulation der Adenylylzyklase die Assemblierung und Aktivierung des MLKP-Komplexes auslöst und dadurch die endotheliale Schranke stabilisiert und vor einem drohenden Versagen schützt.