Charakterisierung Druck-induzierter Ionenströme am Pulmonalepithel von Xenopus laevis

Abstract

Das Lungenepithel landlebender Vertebraten ist von einem dünnen Flüssigkeitsfilm bedeckt, dessen Höhe und Viskosität streng reguliert wird. Die Zusammensetzung wird im wesentlichen durch Ionentransportprozesse der Epithelzellen bestimmt. In der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluss mechanischer Kräfte auf den pulmonalen Ionentransport untersucht. Dazu wurden zum einen elektrophysiologische Messungen (Ussing-Kammer) an nativen Lungenpräparaten des Südafrikanischen Krallenfroschs (Xenopus laevis) durchgeführt, zum anderen wurde der humane epitheliale Na+-Kanal aus Lungengewebe kloniert, in Xenopus Oocyten exprimiert und mittels der Zwei-Elektroden-Spannungsklemme sowie der Patch Clamp Technik untersucht.Als mechanischer Stimulus diente in den Ussing-Kammer-Messungen die Erhöhung des hydrostatischen Drucks um 5 cm Wassersäule. Dies bedingte eine Veränderung folgender Parameter: Reduktion des Kurzschlussstroms (ISC) in voltage clamp Messungen, Reduktion der transepithelialen Potenzialdifferenz in current clamp Messungen, Zunahme der Kapazität sowie Erhöhung der extrazellulären ATP-Konzentration. Eine Inhibition durch Druck konnte verhindert werden, wenn die Wassersäule gleichzeitig sowohl in der apikalen wie auch der basolateralen Kammerhälfte erhöht wurde oder das Gewebe mittels eines Nylonnetzes abgestützt wurde. Die Höhe der Druck-induzierten Inhibition des ISC konnte durch unterschiedliche Pharmaka und Versuchsbedingungen beeinflusst werden. Die apikale Applikation von Ba2+ sowie die Erhöhung der extrazellulären K+-Konzentration führte zu einer Abschwächung des Druckeffekts. Dies macht es wahrscheinlich, dass die Druck-induzierte Strominhibition maßgeblich durch eine Sekretion von K+ über die apikale Membran verursacht wurde. Die Sensitivität gegenüber Clotrimazol, Chlorzoxazon sowie Glibenclamid legt eine Beteiligung Ca2+& #64979;aktivierter K+-Kanäle sowie ATP-abhängiger K+-Kanäle nahe. Die mRNA Expression für die Ca2+-aktivierten K+-Kanäle BK (KCNMA1) und IK (KCNN4) in der Xenopus Lunge wurde durch RT-PCR nachgewiesen. Weiterhin scheinen 2-Poren-Domänen K+-Kanäle durch Druckeinwirkung betroffen zu sein, deren mRNA-Expression für TWIK2 (KCNK6) und TASK2 (KCNK5) gezeigt werden konnte. Neben einer Druck-induzierten Aktivierung von K+-Kanälen wurde eine Stimulation der Chlorid-Sekretion sowie eine Zunahme der Na+-Resorption durch epitheliale Na+-Kanäle (ENaC) beobachtet. Sowohl der ENaC als auch der Chlorid-Kanal CFTR konnten durch RT-PCR nachgewiesen werden. Zusätzlich konnte die Expression des CFTR mittels Immunfluoreszenz dargestellt werden. Die Abhängigkeit des Druckeffekt von der Osmolarität der Perfusionslösung weißt darauf hin, dass der mechanische Stimulus intrinsische Volumenregulationsmechanismen beeinflusst. Nach Applikation von Inhibitoren mechanosensitiver Ionenkanäle (Gd3+ und La3+) wurde der Druckeffekt stark abgeschwächt. Die mechanosensitiven Ca2+-permeablen Ionenkanäle TRPC1 und TRPV4 wurden durch RT& #64979;-PCR in der Xenopus Lunge sowie in humanen Epithelzellkulturen nachgewiesen. Durch Modulation der intrazellulären Ca2+-Konzentration konnte der Druck-induzierte Effekt allerdings nur gering verändert werden. Die Mechanosensitivität des epithelialen Na+-Kanals wurde im Oocytenexpressionsmodell untersucht. Dazu wurde der humane ENaC aus Lungengewebe kloniert, in vitro transkribiert und in Xenopus Oocyten exprimiert. In Ganzzellableitungen zeigte sich eine Zunahme des ENaC-getragenen Stroms durch laminaren Scherstress. In outside-out Patch Clamp Untersuchungen konnte in einigen jedoch nicht allen Messungen eine Zunahme der Kanalaktivität durch den mechanischen Reiz festgestellt werden. Zusammengenommen zeigen die Ergebnisse, dass mechanische Kräfte innerhalb kurzer Zeiträume von wenigen Minuten Ionentransportprozesse in nativen Lungenpräparaten beeinflussen können. The present work investigated the impact of mechanical forces on pulmonary ion transport. Therefore we conducted Ussing chamber measurements on native lung preparations of the clawed frog Xenopus laevis. Further on the human epithelial Na+ channel was cloned from lung tissue, expressed in Xenopus oocytes and investigated by two electrode voltage clamp and patch clamp measurements. Mechanical stimulation in Ussing chamber measurements was achieved by increasing the hydrostatic pressure to 5 cm water column. This led to the change of the following parameters: reduction of the short-circuit current (ISC) in voltage clamp measurements, reduction of the transepithelial potential in current clamp measuremants, increase in capacitance as well as increase in extracellular ATP concentration.The pressure-induced current inhibition could be prevented when the application of hydrostatic pressure occurred at the same time in both chamber compartments or when the tissue was fixed on a nylon mesh. The pressure response was sensitive to various ion channel blockers. It could be prevented by the application of Ba2+ or by increasing the apical K+ concentrations. This shows that the main part of the pressure-induced current inhibition is due to a secretion of K+ via apical channels. The sensitivity towards clotrimazole, chlorzoxazon and glibenclamide points towards an involvement of Ca2+-activated K+ channels as well ATP-dependent K+ channels. The mRNA expression of the Ca2+-activated K+ channels KCNN4 and KCNMA1 was shown by reverse transcriptase PCR. Further the pressure-induced effect was sensitive to blockers of 2 pore K+ channels, whose mRNA expression was shown for KCNK6 and KCNK5. Besides K+ secretion, pressure also induced the activation of Na+ as well as Cl- conductances. Epithelial Na+ channels (ENaCs) as well as the Cl- channel CFTR were detected on the molecular level. The pressure effect was dependent on the solution osmolarity. This may be due to an interference of the mechanical stimulus with intrinsic volume regulation mechanisms. The pressure-induced current inhibition could be attenuated by application of blockers of mechanosensitive channels (Gd3+ and La3+) but showed little dependence on intracellular Ca2+ concentrations. The mechanosensitivity of ENaC was investigated in the Xenopus Oocyte expression system. Laminar shear stress, which was used as a mechanical stimulus, led to an increase in whole cell currents. In outside-out patch clamp studies the channel activity increased in some but not all experiments. Taken together these results show that ion transport processes can be influenced in a short term manner due to application of mechanical forces on native lung preparations.