Molekulare Mechanismen der Mesodermbildung in Platynereis dumerilii (Annelida, Polychaeta)

Abstract

Alle bilateralsymmetrischen Tiere (Bilateria) sind durch den Besitz dreier Keimblätter (Triploblastie), die während ihrer Embryonalentwicklung entstehen, gekennzeichnet. Die Spezifizierung der Keimblätter und deren Trennung durch den Gastrulationsprozess ist einer der grundlegendsten Schritte während der Embryonalentwicklung der Bilateria. Die Untersuchung der zugrunde liegenden molekularen Mechansimen beschränkte sich bis vor kurzem auf die Vertreter der Deuterostomia und der Ecdysozoa. Über die molekularen Grundlagen der Determination der Keimblätter bei den Lophotrochozoa, war bisher fast nichts bekannt. Einen großen Teil der Lophotrochozoa machen die Spiralia aus und inzwischen sind auch einige der Vertreter der Spiralia für die molekularen Methoden der modernen Entwicklungsbiologie zugänglich. Es sind bis heute aber keine molekularen Faktoren identifiziert worden, die das mesodermale Keimblatt der Spiralier determinieren. Zur weiteren Analyse dieser Fragestellung bot sich der Polychaet Platynereis dumerilii als Modellsystem an. In dieser Arbeit wurden die zu twist und snail homologen Gene von Platynereis als Kandidatengene kloniert und ihre Expression in der Früh- und Larvalentwicklung charakterisiert und lokalisiert. Sowohl Platynereis twist als auch Platynereis snail werden maternal in die Eizelle eingelagert und ihre Expression findet sich während der gesamten Embryonalentwicklung. Eine durch Furchungsarrest mit Cytochalasin B vermittelte Zelllinienuntersuchung ergab, dass Pdu-twist in der 4d Zelllinie, die das komplette Rumpfmesoderm der Larve bildet, exprimiert wird. In der Trochophora werden sowohl Pdu-twist als auch Pdu-snail in den Mesodermanlagen, sowie in einem Teil des viszeralen Mesoderms der Larve exprimiert. In atoken Jungwürmern findet sich Pdu-twist Expression in der Wachstumszone in der neue Segmente durch Sprossung gebildet werden, ebenso wie bei regenerierenden Tieren, im präsumptiven Mesoderm sich bildender Segmente. Durch die Injektion von dsRNA in adulte Tiere wurden parentale RNAi vermittelte, funktionelle Analysen durchgeführt. Diese Analysen ergaben, dass es sich bei Pdu-twist, wahrscheinlich in Kooperation mit Pdu-snail, um einen Master-Regulator für mesodermales Zellschicksal in Platynereis handelt, der sowohl eine maternale, als auch eine zygotische Komponente besitzt und dessen Funktionsverlust sowohl zum Ausbleiben der morphogenetischen Gastrulationsbewegungen, als auch der Determination und Differenzierung des Mesoderms im sich entwickelnden Embryo führt. Um die Ergebnisse dieser Experimente zu verifizieren, wurde Pdu-twist heterolog in E. coli exprimiert, das Protein aufgereinigt und durch Immunisierung von Kaninchen polyklonale Antiseren gegen Pdu-Twist hergestellt. Die aufgereinigten Immunseren wurden durch Western Blot Analysen und Immun-fluoreszenzfärbungen auf ihre Spezifität überprüft. Zur Analyse einer in der Evolution eventuell konservierten Funktion der Twist Transkriptionsfaktoren, wurden UAS-Pdu-twist transgene Drosophila hergestellt und für Rettungsexperimente an twist und twist-, snail- Drosophila Stämmen benutzt. In den Experimenten fanden sich keine geretteten Phänotypen, was dafür spricht, dass Drosophila twist nicht durch Platynereis twist ersetzt werden kann. Dies ist das erste Mal, dass außerhalb der Insekta ein funktioneller Zusammenhang zwischen der Expression eines Twist Transkriptionsfaktors und der Spezifizierung mesodermalen Zellschicksals sowie der Gastrulation experimentell nachgewiesen wurde. Diese Ergebnisse eröffnen die Möglichkeit die molekularen Grundlagen der Mesodermspezifizierung bei inäqual furchenden Spiraliern näher zu analysieren und die durchgeführten Zellstammbaumanalysen mit molekularen Daten zu kombinieren. Platynereis twist ist die erste Keimblattdeterminante, die in Spiraliern bisher identifiziert wurde. Ebenfalls lassen sich durch vergleichende Analysen Rückschlüsse auf eine ursprüngliche Funktion der Twist-like Transkriptionsfaktoren bei der Aktivierung von Transkriptionskasetten, die für Zellbewegung, Zellform und Zellteilung zuständig sind, ziehen.