Regulation of the NF-kappaB p65 subunit by phosphorylation and ubiquitination

Abstract

The inducible transcription factor NF-kappaB regulates a wide variety of target genes and plays a key role in many biological processes. While all NF-kappaB activation pathways share a critical step involving proteasome-mediated degradation of inhibitory proteins and the release of DNA-binding subunits, NF-kappaB itself is also regulated by post-translational modification of the DNA-binding subunits. This second level of regulation is required to determine the specificity and to control the amplitude as well as duration of the transcriptional response. This study identified IKKepsilon as a novel p65 kinase mediating inducible phosphorylation at Ser 468 and also Ser 536 in response to T cell costimulation. In costimulated T cells, multiple experimental approaches revealed an important role of IKKepsilon for p65 phosphorylation at Ser 468, whereas Ser 536 phosphorylation also occurred in the absence of this kinase. These results also provide a mechanistic clue that helps to explain the relevance of IKKepsilon for the expression of a subset of NF-kappaB target genes without affecting IKK activity. The functional role of these phosphorylation sites was tested in reconstitution experiments. Gene arrays and real-time PCR analyses showed that the effect of Ser 468 phosphorylation depends on the individual target gene. While some genes show strict dependency on the integrity of this phosphorylation site, other genes are expressed at even higher rates when the phosporylatable serine is replaced by an alanine. The latter finding can be explained by an increased stability of the mutated p65 protein, which is largely refractory to ubiquitination and proteasome-dependent elimination. Further experiments showed that TNF-induced p65 phosphorylation at Ser 468 controls its ability to associate with COMMD1 and Cullin-2, components of a multisubunit ubiquitin ligase complex. These proteins in turn mediate p65 ubiquitination and allow for proteasome-dependent degradation of this transcription factor. ChIP assays revealed that phosphorylation of p65 at Ser 468 leads to ubiquitin/proteasome-dependent removal of chromatin-bound p65, thus contributing to the selective termination of late NF-kappaB-dependent gene expression. Der induzierbare Transkriptionsfaktor NF-kappaB reguliert zahlreiche Zielgene und spielt bei unterschiedlichen biologischen Prozessen eine zentrale Rolle. NF-kappaB kann durch verschiedene Signalwege aktiviert werden, die letztlich durch einen Proteasomen-vermittelten Schritt zur Generierung von freien, DNA-bindenden Untereinheiten führen. Die Aktivität der DNA-bindenden Untereinheiten kann durch posttranslationale Modifikation weiter gesteuert werden. Diese zweite Regulationsebene beeinflusst die Spezifität, Amplitude und Dauer der transkriptionellen Aktivierung. In dieser Studie wurde die Serin/Threonin Kinase IKKepsilon als eine neue Kinase für die NF-kappaB p65 Untereinheit identifiziert, welche in costimulierten T Zellen für die induzierbare Phosphorylierung an den Serinen 536 und 468 verantwortlich ist. Unterschiedliche experimentelle Strategien zeigten die Wichtigkeit von IKKepsilon für die induzierbare Serin 468 Phosphorylierung, während das C-terminale Serin 536 auch von anderen Kinasen modifiziert werden konnte. Diese Ergebnisse erlauben auch ein mechanistisches Verständnis von früheren Studien, welche in IKKepsilon defizienten Zellen eine intakte IkappaBalpha Degradation und DNA-Bindung, aber Defekte in der induzierbaren Expression von selektiven NF-kappaB Zielgenen gemessen hatten. Die funktionelle Rolle dieser Phosphorylierungen wurde durch Rekonstitutionsexperimente untersucht. Gene array und real-time PCR Experimente zeigten, dass die funktionellen Konsequenzen der p65 Serin 468 Phosphorylierung vom individuellen Zielgen abhängen. Während die Expression einiger Gene die Intaktheit dieser Phosphorylierungsstelle benötigen, war die Expression anderer Gene davon unbeeinflusst und weitere Gene zeigten sogar eine verstärkte Expression. Der letztere Befund kann molekular dadurch erklärt werden, dass die TNF-induzierte p65 Serin 468 Phosphorylierung die Bindung des Transkriptionsfaktors an COMMD1 und Cullin-2 erlaubt, zwei Komponenten eines Multi-Protein Ubiquitin E3 Ligase Komplexes. Die anschliessende Polyubiquitinierung von p65 führt zum proteasomalen Abbau des Transkriptionsfaktors und stellt somit in selektiver Weise die Termination einzelner Gene während der späten NF-kappaB Antwort sicher.