Charakterisierung des Eimeria bovis Mikronemenproteins 4 (EbMIC4) und erste Studien zur Modulation des Wirtszell-Proteoms durch Eimeria bovis

Abstract

Eimeria bovis ist ein intrazellulärer Darmparasit und einer der pathogensten Erreger der bovinen Kokzidiose. Während der endogenen Entwicklung kommt es in der ersten Merogonie in vivo zur Bildung kleiner gleich 300 mym großen Makromeronten im Verlauf von > 2 Wochen. Als Mitglieder der Apikomplexa besitzen alle invasiven Stadien spezielle Organellen und Strukturen, die in ihrer Gesamtheit als Apikalkomplex bezeichnet werden. Die Mikronemen stellen spezialisierte sekretorische Organellen dieses Komplexes dar, die ihre Proteine bei einer stimulierten Exozytose sezernieren. Die Mikronemenproteine spielen eine entscheidende Rolle bei der Fortbewegung des Parasiten und der Invasion einer Wirtszelle. Mitglieder dieser Proteinfamilie stellen Verbindungsglieder zwischen der Oberfläche der Wirtszelle und dem Aktinomyosinmotor des Parasiten dar. Ein Ziel dieser Studie war die Charakterisierung von E. bovis-spezifischen Mikronemenproteinen. Mittels verschiedenster Methoden wurde eine genomische DNA-Sequenz (single copy-Gen) mit ca. 8700 bp identifiziert. Die kodierende Sequenz, verifiziert über RT-PCR, umfasst 5481 bp. Die vorhergesagte Proteinsequenz besteht aus 1827 aa, mit einem MW von 191,45 kDa und einem pI von 4,14. Homologievergleiche sprechen für ein homologes Protein zum Mikronemenprotein 4 von Eimeria tenella (EtMIC4). Charakterisiert als Transmembranprotein der TRAP Proteinfamilie, beinhaltet es im extrazellulären Anteil 31 epidermal growth factor- ähnliche Domänen, die von Bereichen mit Thrombospondin-1-Domänen eingerahmt werden. Daneben zeichnet sich EbMIC4 durch eine hochkonservierte Transmembrandomäne sowie einen kurzen zytoplasmatischen Teil mit konservierten Tyrosin- und Tryptophanresten aus. Außerhalb der Apikomplexa besteht eine hohe Ähnlichkeit zur Proteingruppe der Fibrilline. Vergleichende Analysen mit anderen Mikronemenproteinen zeigten, dass EbMIC4 viele Gemeinsamkeiten mit diesen Proteinen besitzt. Sequenzbereiche, die für den gerichteten Transport zu den Mikronemen bedeutend sind, waren genauso konserviert wie potentielle Phosphorylierungsstellen oder bestimmte Aminosäuren. EbMIC4 wurde bei beiden invasiven Stadien, Sporozoiten und Merozoiten I, vor allem im apikalen Bereich nachgewiesen. Im Gegensatz zum hier ebenfalls klonierten Ebhsp70, das über die gesamte Entwicklungszeit konstitutiv transkribiert wurde, zeigte sich bei Ebmic4 ein differenzierteres Bild. Anfangs im intrazellulären Sporozoiten noch deutlich nachweisbar, war das Transkript von Ebmic4 ab dem 4./5. Tag p. i. nur noch in geringen Mengen vorhanden. Mit dem ersten Auftreten von immaturen Meronten (ca. 10./12. Tag p. i.) stiegen die Transkriptmengen wieder an und nahmen mit der massiven Vermehrung und Reifung der Merozoiten I zu. Die Expressionsstudien von EbMIC4 während der ersten Merogonie zeigten ein vergleichbares Bild. Weiterhin wurden Experimente zur Interaktion des Parasiten mit seiner Wirtszelle durchgeführt. Eine Besonderheit bei E. bovis ist in vivo die lange Verweildauer während der ersten Merogonie in Endothelzellen der zentralen Lymphkapillaren des Ileums. Um eine so lange Zeit in einer Zelle zu überleben, erscheint es unumgänglich, dass der Parasit Vorgänge der Wirtszelle gezielt beeinflusst. Um erste Anhaltspunkte für eine mögliche Manipulation der Wirtszelle zu erhalten, wurden die Gesamtproteome von E. bovis-infizierten Wirtszellen mit denen nicht-infizierter Wirtszellen am 14. Tag p. i. miteinander verglichen. Dazu wurde eine zweidimensionale Auftrennung der zu vergleichenden Proteinproben mit anschließender MALDI-TOF-Fingerprinting-Analyse bezüglich hoch- oder runterregulierter Proteine vorgenommen. Allgemein wurden über E. bovis wesentlich mehr Proteine runter- als hochreguliert. Modifiziert wurden vor allem Proteine des Stoffwechsels und der Biosynthese, Strukturproteine, Proteine der Translation und Transkription sowie Proteine der Apoptose. Dabei bestätigten diese Studien frühere Arbeiten, bei denen gezeigt wurde, dass E. bovis die Apoptosefähigkeit der Wirtszelle beeinträchtigt. Eimeria bovis is an intracellular protozoan parasite of cattle and one of the most pathogenic coccidial species. In the course of its endogenous development Eimeria bovis undergoes two merogonies. During the first merogony in vivo so called macromeronts of size of up to 300 µm are formed within 2-3 weeks containing up to 100000 merozoites each. As a member of the substrain Apicomplexa, all invasive stages have specialised secretory organelles and structures which form the apical complex. Micronemes are specialised secretory organelles of this complex which secrete their proteins in the course of a stimulated exocytosis. Microneme proteins play a decisive role in parasite motility and invasion of the host cell. Recent studies demonstrated that they are the connecting link between the unique form of actin-based motor complex of the parasite and the host cell surface. One aim of this study was the identification and characterisation of a microneme protein of Eimeria bovis (EbMIC4). Employing several different methods we identified a genomic DNA-sequence (single copy gen) with a length of approximately 8700 bp. The coding sequence, verified by reverse transcriptase-PCR, consisted of 5481 bp distributed within eight exons. The predicted polypeptide sequence consists of 1827 amino acids with a molecular mass of 191 kDa and an isoelectric point of 4.14. The polypeptide sequence shows a high homology to EtMIC4, a microneme protein of Eimeria tenella, and to EmTSP250 a microneme protein of Eimeria maxima. Therefore we called the identified protein EbMIC4. Analysis of the amino acid sequence revealed it as a novel member of the TRAP (thrombospondin-related anonymous protein) family, containing 31 epidermal growth factor-like binding domains and two areas with thrombospondin type-1 repeats in the extracellular domain. EbMIC4 contains a short transmembrane domain and a cytoplasmatic tail, which both are highly conserved within apicomplexan microneme proteins. The protein family of the fibrillines exhibits the highest homology to EbMIC4 beyond the Apicomplexa. EbMIC4 has many similarities to other microneme proteins. Sequence areas which are very important for the directional transport to the micronemes, potentiell phosphorylation sites or several amino acids are conserved. Applying several different methods we analysed the gene transcription and protein expression patterns of EbMIC4. EbMIC4 was detected in the apical area of the investigated invasive stages sporozoites and merozoites I. Compared with the constitutively transcribed Ebhsp70, a gene encoded for heat shock protein of Eimeria bovis, which was also identified in this study, a different picture was observed for Ebmic4. The Ebmic4 transcripts were clearly detectable in intracellular sporozoites but could be found only in scarce amounts 4th or 5th day post infection. With the appearance of immature meronts (10 to 12 days p. i.), the amounts of Ebmic4-transcripts increased and were highly abundant after the maturation of merozoites I. The expression patterns of EbMIC4 in the course of the merogony were similar to those of the transcripts. Further experiments were performed to analyse interactions between the parasite and its host cell on the molecular level. Since Eimeria bovis macromeront development in vivo in endothelial cells of the lymph capillaries requires a relatively long period of time of 2-3 weeks, it appears plausible that the parasit manipulates its host cell to guarantee its survival. Thus, we compared the proteomes of E. bovis-infected and non infected cells 14 days post infection. Using two-dimensional electrophoresis and mass spectrometry we identified host cell proteins which were either down or upregulated owing to the infection. In principle, we detected more down regulated than up regulated proteins. Modified protein expressions were found in metabolic pathways particularly involved in glycolysis and with respect to structural proteins, proteins participating in transcription, translation and in apoptotic processes. Referring to the latter, this study supports recent data showing that E. bovis actively interferes with host cell apoptosis.