Molecular studies on compatibility in the mutualistic plant root-Piriformospora indica interaction

Abstract

Plants have developed diverse strategies for protection against the threat of invading pathogens. In order to improve their performance as well as to evade abiotic and biotic stresses, one strategy of plants is to establish associations with beneficial microbial organisms. Piriformospora indica is a root interacting fungus, which transfers several benefits to colonized plants like a better tolerance to various biotic and abiotic stresses, as well as an improved plant growth and yield. P. indica colonizes a broad range of monocot and dicot plants. This broad host range indicates that P. indica has developed efficient strategies to overcome innate immune responses and to manipulate the metabolism in different plants. This is even more intriguing as the fungus was shown to follow an initial biotrophic colonisation strategy at which penetrated cells are living. Plant colonizing microbes are known to secrete proteins (also called effectors) in order to modify host physiology and modulate plant defense mechanisms and, hence, confer compatibility. The aim of this study was to identify P. indica effector proteins as well as plant compatibility factors that are involved in the manipulation of those processes required for successful fungal establishment in planta. Therefore, two different strategies were followed. In the first approach, the so-called yeast signal sequence trap (YSST) assay was established. As the result of YSST, several plant genes were identified that are known to be involved in stress responses and cell wall development. These genes were shown to have a specific expression in barley roots during P. indica colonisation. In addition, a fungal gene was identified that does not show any similarities to other sequences deposited in public databases. The identified P. indica protein (PIALH43) carries a signal peptide and was shown to be induced during barley root colonisation. Interestingly, PIALH43 harbours a highly conserved C-terminal RING finger motif. In silico protein modelling of PIALH43 confirmed a 3D structural overlap and verified the accurate conformation of the E2 binding residues when compared with known human and plant ubiquitin ligases. Moreover, E3 ligase activity of PIALH43 was confirmed in vitro. Currently, PIALH43 is overexpressed in planta and in P. indica in order to study its function in mutualistic root colonisation. In a second approach, a simplified subtraction-based assay, designated Transcript Subtractive Hybridization (TSH), was established to identify and study plant compatibility factors in the barley-P. indica interaction. The subtraction assay delivered various differentially regulated genes. These genes are known to be involved in stress responses, phytohormone- and secondary metabolism, autophagy, and protein processing. Among the up-regulated candidates was a gene encoding S-adenosylmethionine synthetase 2, which is thought to be involved in the synthesis of ethylene. De novo synthesis of ethylene during root colonization was verified by quantifying the ethylene precursor 1-aminocyclopropane 1-carboxylic acid (ACC) in barley and by cytologically monitoring GUS accumulation in ACC synthase reporter plants of Arabidopsis. In addition, the effects of ethylene precursor ACC or ethylene antagonist 1-methylcyclopropene (MCP) was determined. In these pharmacological experiments, barley plants were about 40% less colonised by P. indica after application of MCP while treatment with ACC resulted in significant increase (~ 60%) in colonization. To further elucidate the impact of ethylene on plant root colonization by P. indica, genetic analyses were performed with Arabidopsis mutants altered in ethylene synthesis and signaling at early biotrophic (~ 3 dai) and later cell death-associated colonization phases (~ 14 dai). In accordance with the studies in barley, Arabidopsis mutants ctr1-1 (constitutive ethylene signaling) and eto1-1 (ethylene overproducer) exhibited a significant increase in fungal colonization (especially at later interaction stages), while a reduced colonization was observed in ein2-1 (ethylene insensitive). In summary, ethylene might function as general plant compatibility factor in the plant-P. indica system. Pflanzen haben verschieden Strategien entwickelt, um sich vor den Bedrohungen durch eindringende Pathogene zu schützen. Um ihre Leistungsfähigkeit zu verbessern und abiotischem und biotischem Stress zu entgehen, besteht eine Strategie der Pflanzen darin, Verbindungen mit nützlichen Mikroorganismen einzugehen. Piriformospora indica ist ein Pilz, der mit Pflanzenwurzeln interagiert und der besiedelten Pflanze verschiedene Vorteile verschafft, zum Beispiel eine bessere Toleranz gegenüber verschiedenen biotischen und abiotischen Stressfaktoren, verbessertes Wachstum und höhere Ernteerträge. P. indica ist in der Lage, ein breites Spektrum an monokotylen und dikotylen Pflanzen zu besiedeln. Dieses breite Wirtsspektrum deutet darauf hin, dass P. indica effiziente Mechanismen entwickelt hat, um pflanzliche Immunantworten zu überwinden und den Metabolismus verschiedener Pflanzen zu manipulieren. Dies ist umso mehr erstaunlich, da gezeigt werden konnte, dass der Pilz zu Beginn der Besiedlung in einer biotrophen Phase lebende Zellen penetriert. Pflanzen besiedelnde Mikroorganismen sekretieren bekanntermaßen Proteine (so genannte Effektoren), um die Wirtsphysiologie zu verändern, die Abwehrmechanismen der Pflanze zu modulieren und schließlich Kompatibilität zu erreichen. Das Ziel dieser Untersuchungen war es, Effektorproteine von P. indica und Kompatibilitäts-faktoren der Pflanze zu identifizieren, die an manipulativen Prozessen beteiligt sind und die erfolgreiche Etablierung des Pilzes in der Pflanze ermöglichen. Hierfür wurden zwei verschiedene Strategien verfolgt. Zunächst wurde der so genannte yeast signal sequence trap (YSST) etabliert. Als Ergebnis des YSST konnten verschiedene pflanzliche Gene identifiziert werden, die an Stressantworten und Zellwandbildung beteiligt sind. Es wurde gezeigt, dass diese Gene spezifisch in Gerstenwurzeln exprimiert wurden, wenn diese mit P. indica besiedelt waren. Zusätzlich konnte ein pilzliches Gen identifiziert werden, das keinerlei Ähnlichkeiten mit bisher bekannten Sequenzen aus öffentlich zugänglichen Datenbanken aufweist. Das entdeckte P. indica-Protein (PIALH43) trägt ein Signalpeptid, es wurde gezeigt, dass es während der Besiedlung von Gerstenwurzeln exprimiert wird. Interessanterweise beinhaltet PIALH43 ein stark konserviertes, C-terminales RING-Finger Motiv. In silico Proteinmodellierung von PIALH43 bestätigte eine dreidimensinole Überlappung und wies die genaue Konformation der der E2-Bindestellen im Vergleich mit bekannten menschlichen und pflanzlichen Ubiquitin-Ligasen nach. Die E3-Ligase-Aktivität konnte in vitro bekräftigt werden. Im Moment wird PIALH43 in der Pflanze (Arabidopsis thaliana) und in P. indica überexprimiert, um seine Funktion in der mutualistischen Wurzelkolonisierung zu studieren. In einer weiteren Annäherung wurde eine vereinfachte, auf Subtraktion basierende Methode, bezeichnet als Transcript Substractive Hybridization (TSH), etabliert. Mit Hilfe dieser Methode wurden pflanzliche Kompatibilitätsfaktoren der Gerste-P. indica Interaktion identifiziert und studiert. Die Subtraktionsmethode lieferte viele verschieden regulierte Gene. Die gefundenen Gene sind bekanntermaßen in Stressantworten, Phytohormon- und Sekundärmetabolismus, Autophagie und Proteinprozessierung beteiligt. Unter den hochregulierten Kandidaten war eine S-Adenosylmethionin-Synthetase 2, bei der vermutet wird, dass sie in der Synthese von Ethylen eine Rolle spielt. Die de novo Synthese von Ethylen während der Wurzelbesiedlung wurde durch die Quantifizierung des Ethylen-Vorläufers 1-Aminocyclopropan-1-carboxylsäure (ACC) in Gerste und durch zytologische Kontrolle der Akkumulation von GUS in ACC-Synthase-Reporterpflanzen (Arabidopsis) bestätigt. Zusätzlich wurden die Effekte des Ethylen Vorläufers ACC und des Ethylen-Antagonists 1-Methylcyclopropene (MCP) auf die Besiedlung bestimmt. In diesen pharmakologischen Untersuchungen waren Gerstenpflanzen nach der Zugabe von MCP um etwa 40 % weniger mit P. indica besiedelt, während die Behandlung mit ACC zu einem signifikanten Anstieg (~ 60 %) in der Besiedlung führte. Um den Einfluss von Ethylen auf die Besiedlung von Pflanzenwurzeln durch P. indica weiter zu beleuchten, wurden genetische Untersuchungen mit Arabidopsis-Mutanten, deren Ethylensynthese und Ethylen-Signalwege verändert waren, in der frühen biotrophen (~ 3 days after inoculation, dai) und späteren Zelltod-assoziierten Phase (~ 14 dai) durchgeführt. In Übereinstimmung mit Studien in Gerste waren die Arabidopsis-Mutanten ctr1-1 (Ethylen-Signalweg konstitutiv aktiv) und eto1-1 (Ethylen-Überproduzierer) signifikant stärker besiedelt, vor allem in späteren Interaktionsstadien. Bei der Ethylen-insensitiven Mutante ein2-1 wurde hingegen eine reduzierte Besiedlung beobachtet. Zusammenfassend scheint Ethylen ein genereller Kompatibilitätsfaktor zu sein, der durch den Pilz rekrutiert wird, um verschiedene Wirtspflanzen zu besiedeln, wie hier beispielhaft an den Modellpflanzen Gerste und Arabidopsis gezeigt werden konnte.