Charakterisierung der B-Zell-Regulation und funktioneller Effekte von Autoantikörpern bei Kindern mit Opsoklonus-Myoklonus-Syndrom

Abstract

Das pädiatrische Opsoklonus-Myoklonus-Syndrom (OMS) ist eine seltene neurologische Erkrankung mit Augenbewegungs- und Koordinationsstörungen, die oft in Zusammenhang mit Neuroblastomen (NB) als paraneolastisches Syndrom auftritt. Nachdem im Serum einiger Patienten auch Auto-Antikörper (Auto-AK) gegen Oberflächenepitope von NB-Zellen und Kleinhirnneuronen nachgewiesen wurden, wird eine Autoimmunpathogenese des OMS diskutiert. Ein gemeinsames Auto-Antigen konnte bisher noch nicht identifiziert werden. Zur Eingrenzung der möglichen Auto-Antigene wurde in der vorliegenden Arbeit zuerst eine IgG-Subklassen-Analyse durchgeführt. Sowohl die Auto-AK gegen intrazelluläre als auch gegen Oberflächen-Epitope von zerebellären Neuronen gehörten hauptsächlich zur IgG-Subklasse 3 und IgG-Subklasse 1, was auf ein Protein-Antigen hindeutet. IgG1 und IgG3 werden u.a. von Makrophagen und NK-Zellen erkannt. Da OMS-Patienten eine bessere Prognose hinsichtlich des zugrunde liegenden Tumorleides haben, wurde postuliert, dass die Auto-AK von OMS-Patienten eine Erhöhung der NK-vermittelten Tumorzelllyse zur Folge haben. Wenn NB-Zellen vor der Ko-Kultivierung mit NK-Zellen mit OMS-IgG inkubiert wurden, war eine signifikante Steigerung der Zytotoxizität nachweisbar (Zytotoxizität: gesunde Kontroll-Patienten = 34,02 %, OMS-Patienten = 53,09 %; p < 0,005). OMS-Patienten zeigen im Liquor hauptsächlich eine B-Zell Antwort. Wegen der geringen Anzahl B-Zellen im Liquor ist eine durchflusszytometrische Analyse der B-Zellen im Liquor schwierig und die Liquor-Menge bei Kleinkindern ist limitiert. Deshalb wurde ein weiterer verlässlicher Marker der B-Zell Aktivität im Liquor gesucht.Einiges deutet darauf hin, dass an der Entstehung von Autoimmunerkrankungen zwei Proteine der Tumor-Nekrose-Faktor-Familie (TNF-Familie) beteiligt sind, BAFF (B-Zell aktivierender Faktor aus der TNF-Familie) und APRIL (A proliferation inducing ligand). Beide Proteine wirken in unterschiedlichem Maße an der Entwicklung und dem Überleben von B-Zellen mit.Ich konnte eine erhöhte BAFF-Konzentration im Liquor von OMS-Patienten im Vergleich zu gesunden Kontrollen nachweisen (Mittelwerte: GK = 0,09 ng/ml, OMS = 0,36 ng/ml). Da bei den OMS-Patienten keine Störung der Blut-Hirn-Schranke nachweisbar war, muss die erhöhte Menge BAFF intrathekal produziert worden sein. Die APRIL-Konzentrationen von OMS- Patienten unterschieden sich nicht von denen gesunder Kontroll-Patienten. Weitere Versuche zeigten, dass eine Korrelation zwischen den Oberflächen-bindenen AK gegen Kleinhirnneurone mit der BAFF-Konzentration im Liquor bestand. Dies macht eine quantitative Analyse von BAFF als stellvertretendem Marker für die Aktivierung des B-Zell Systems in OMS-Patienten möglich.Es ist bekannt, dass APRIL, BAFF und ihre Rezeptoren von Immunzellen sowie Tumorzellen exprimiert und synthetisiert werden. Die Neuroblastome von pädiatrischen OMS-Patienten enthalten vermehrt aktive Lymphfollikel, die vorwiegend B-Zellen enthalten. Daher wurde die Synthese und die Sekretion von BAFF und APRIL, sowie die Oberflächenexpression von BAFF-R durch NB-Zellen überprüft. Es konnte sowohl für NB- als auch für Kontroll-Zelllinien eine Synthese von APRIL gezeigt werden. Eine Sekretion von APRIL konnte bei keiner der getesteten Zelllinien nachgewiesen werden. BAFF wurde von fast allen getesteten NB-Zelllinien synthetisiert, aber nur von einer der zwei Kontoll-Zelllinien. BAFF-RNA konnte sowohl bei allen getesteten NB-Zelllinien, als auch bei den Kontroll-Zelllinien nachgewiesen werden, wobei im Schnitt die Menge an BAFF-RNA in NB-Zelllinien höher war als in den Kontroll-Zelllinien. Eine BAFF-Sekretion oder eine Oberflächen-Expression von BAFF-R konnte in keiner NB-Zelllinie gemessen werden. Eine Stimulation von NB-Zellen mit dem proinfammatorischen Zytokin Interferon (IFN)-gamma hatte keine Erhöhung der APRIL-Expression zur Folge. Die Sekretion von APRIL und BAFF konnte nach Stimulation mit IFN-gamma bei keiner NB-Zelllinie nachgewiesen werden, obwohl auf RNA-Ebene eine Transkriptions-Steigerung des BAFF-Gens bei vier NB-Zelllinien nachgewiesen werden konnte. Allerdings wurde weder bei den NB-, noch bei der Kontroll-Zelllinie eine erhöhte Menge intrazellulär exprimiertes BAFF gefunden. Auch eine Expression von BAFF-R auf der Zelloberfläche konnte durch die IFNgamma-Stimulation nicht induziert werden. Zusammenfassend konnte im Rahmen dieser Arbeit gezeigt werden, dass beim pädiatrischen OMS vorwiegend Oberflächen-bindende Auto-AK der Subklassen IgG1 und IgG3 vorliegen, welche die NK-Zell-vermittelte Tumorzelllyse von NB-Zellen steigern können. Diese Auto-AK korrelieren im Liquor mit der Konzentration des B-Zell-aktivierenden Faktors BAFF, der möglicherweise als Surrogatmarker für die Aktivität des B-Zell-Systems im Liquor geeignet ist.