Identifikation und funktionelle Charakterisierung von kombinierten Genom-Bindestellen für CTCF und TR

Abstract

Die phänotypischen Unterschiede von Zellen und deren Antwort und Anpassung an Umwelteinflüsse wird unter anderem durch Regulation der Gentranskription gewährleistet. Der in Vertebraten ubiquitär exprimierte und hoch konservierte Transkriptionsfaktor CTCF ist auf vielfältige Weise in die Regulation der Expression genetischer Information involviert. Die Tatsache, dass CTCF in höheren Eukaryoten der einzig bekannte Faktor ist, der Enhancer-Blockade vermitteln kann, verdeutlicht seine große Bedeutung. Dabei werden Gene von unerwünschten Enhancer-Einflüssen abgeschirmt, die für die Regulation anderer Gene verantwortlich sind. CTCF-Bindestellen können sich in enger räumlicher Nachbarschaft zu Bindestellen für den Thyroidhormon-Rezeptor (TR), einem Mitglied der Familie der Kernhormonrezeptoren befinden. Für diese kombinierten Bindestellen wurde bereits gezeigt, dass Thyroidhormon (T3) die Enhancer-Blockade regulieren kann. Es stellt sich die Frage, durch welche Faktoren die hormonsensitive Enhancer-Blockade reguliert wird, und ob weitere benachbarte Bindestellen für CTCF und TR im Genom existieren.In der vorliegenden Arbeit konnte mit E6-AP ein zusätzlicher Cofaktor von CTCT und TR identifiziert werden. GST Pulldown-Experimente zeigen eine in vitro-Interaktion von E6-AP mit CTCF und in der Anwesenheit von Hormon mit TR. E6-AP übt zwei voneinander unabhängige Funktionen aus. Zum einen ist es ein Coaktivator für Kernhormonrezeptoren, zum anderen fungiert E6-AP als E3-Ubiquitin-Ligase. In Studien, bei denen E6-AP im Enhancer-Blockade-Assay überexprimiert wurde, zeigt sich ein geringer Einfluss auf die Enhancer-Blockade.Des Weiteren wurden 126 durch den TR regulierte Gene mittels in silico-Analysen auf kombinierte CTCF- und TR-Bindestellen untersucht. Dabei konnten 17 Gene identifiziert werden, die eine benachbarte Bindestelle von CTCF und TR haben. Die Durchführung von EMSA-Experimenten verifizierte bei 10 kombinierten Bindestellen eine in vitro-Interaktion mit der jeweiligen Sonde. Die neu identifizierten Elemente wurden in ein Vektorsystem integriert, welches es erlaubt, diese auf ihre Funktionalität hin in Bezug auf hormonsensitive Enhancer-Blockade zu untersuchen. Dabei zeigt das benachbarte Bindeelement des ERRα-Gens Enhancer-Blockade, die durch die Zugabe von T3 aufgehoben wird. Wie schon für die Bindestellen F1 und F2 aus dem Hühner-Lysozym-Silencer gezeigt wurde, ist auch bei der kombinierten Bindestelle des ERRα Gens die Vermittlung einer funktionellen Enhancer-Blockade in der Abwesenheit von Hormon unmittelbar von der Präsenz des TR abhängig