AUP1 (Ancient Ubiquitous Protein 1) is a negative regulator of pro-inflammatory cytokine signaling

Abstract

In the progress of seeking for new partners of IRAK4 - a critical kinase of theIL-1R/TLR signaling pathways - using the yeast two-hybrid screening, AUP1(Ancient Ubiquitous Protein 1) was identified to interact with IRAK4. AUP1 is aprotein which is highly conserved in evolution and is ubiquitously expressed intissues of mouse and human. However, the functions of AUP1 in cell biology havenot been clearly defined yet.The interaction of AUP1 was confirmed for the interaction with IRAK4 and IRAK1in HEK293RI cells. Interestingly, AUP1 was only found to interact with kinaseinactive IRAK4 and IRAK1 but not with the wild type molecules, indicating that thekinase activity of IRAK molecules interferes with their association with AUP1. Inaddition, AUP1 can be phosphorylated by IRAK4 and possibly IRAK1 as shown inthe forced co-immunoprecipitation and in vitro kinase assays. Besides IRAK4 andIRAK1, AUP1 interacts with other components in the IL-1 signaling machinerysuch as IL-1RI, MyD88, Tollip, TRAF6, suggesting the involvement of AUP1 in theIL-1 pathway.Indeed, overexpression of AUP1 in HEK293RI and KeratinoRI-/- cells reduces IL-1beta- and LPS-induced activation of NF-kappaB as well as chemokine/cytokineproduction, respectively. However, the regulatory effect of AUP1 overexpression isnot specific for IL-1 or LPS signaling as TNFalpha signaling is also impaired by AUP1overexpression. AUP1 was also found to associate with TNFR1, TRADD andTRAF2 which are components of TNFalpha; pathway. Interestingly, althoughoverexpression of AUP1 does not affect STAT-mediated IL-6 signaling, AUP1interacts with the IL-6R alpha chain but not with the signaling transducer gp130. Incontrast, silencing of AUP1 via siRNA enhances the IL-1beta-, TNFalpha-stimulatedactivation of NF-kappaB as well as IL-6-stimulated activation of STAT3, indicating thatAUP1 is a common negative regulator of the cytokine signaling pathwaysinvestigated.As overexpression of AUP1 interferes with IL-1beta/LPS signaling transductionupstream of IkappaB and the JNK/p38 MAPK and AUP1 was found to associate with allthree of the cytokine receptors IL-1RI, TNFR1 and IL-6R alpha, the role of AUP1 maybe to down-regulate the response of cells to outside stimuli via the impairment ofthe expression and/or performance of these receptors on the cell surface. Im Rahmen der Suche nach neuen Wechselwirkungspartnern von IRAK4 einerkritischen Kinase des IL-1R/TLR Signalwegs- wurde mit dem yeast two hybrid -System AUP1 (Ancient Ubiquitious Protein 1) als Partner von IRAK4 identifiziert.AUP1 ist ein Protein, das in der Evolution stark konserviert ist und ubiquitär inGeweben der Maus und des Menschen exprimiert wird. Die Funktionen von AUP-1in der Biologie der Zelle sind bis heute weitgehend ungeklärt.Die direkte Proteinwechselwirkung von AUP1 mit IRAK4 und IRAK1 wurde in derZelllinie HEK293RI nachgewiesen. Interessanterweise konnte AUP1 nur mit denKinase-inaktiven Varianten von IRAK4 und IRAK1 immunpräzipitiert werden,jedoch nicht mit den Wildtyp-Molekülen, was darauf hindeutet, dass dieKinaseaktivität der IRAK-Moleküle mit der Assoziation von AUP1 interferiert.Zusätzlich konnte durch forcierte Koimmunpräzipitationen mit anschließendem invitro Kinase Assay gezeigt werden, dass AUP1 durch IRAK4, und möglicherweiseauch durch IRAK1, phosphoryliert werden kann. Neben IRAK4 und IRAK1interagiert AUP1 mit weiteren Komponenten der IL-1 Signaltransduktionsmaschineriewie z.B. IL-RI, MyD88, Tollip, TRAF6, was nahe legt, dass AUP1 imIL-1 Signalweg eine Rolle spielt.Überexpression von AUP1 in HEK293RI und KeratinoRI-/- Zellen verringerte dieIL-1beta- oder LPS-induzierte Aktivierung von NF-kappaB genauso wie die Chemokin/Zytokinproduktion. Dieser negativ regulatorische Effekt der Überexpression vonAUP1 ist jedoch nicht spezifisch für die IL-1 oder die LPS Signaltransduktion, dadie durch TNFalpha ausgelösten Signale ebenfalls durch AUP1 Überexpressionbeeinflusst wurden. AUP1 assoziierte auch mit TNFR1, TRADD und TRAF2; alledrei Moleküle sind Bestandteile des TNFalpha-Signalwegs. Die Überexpression vonAUP1 beeinflusste die STAT-vermittelte IL-6 Signaltransduktion zwar nicht,dennoch konnte gezeigt werden, dass AUP1 an die IL-6 Rezeptor alpha-Kette bindet,jedoch nicht an der signaltransduzierende gp130 Untereinheit. Im Gegensatz zurÜberexpression, verstärkte das Ausschalten von AUP1 mittels siRNA-Technik dieIL-1beta- und TNFalpha-stimulierte Aktivierung von NF-kappaB ebenso wie die IL-6-stimulierte Aktivierung von STAT3. Dies weist darauf hin, dass AUP1 eingeneralisierter negativer Regulator der hier untersuchten Zytokinsignalwege ist. Dadie Wirkung der Überexpression von AUP1 im IL-1beta/LPS Signalweg oberhalb vonIkappaB und dem JNK/p38 MAPK Element einzuordnen war und zudem AUP1 an dendrei untersuchten Zytokinrezeptoren IL-1RI, TNFR1 and IL-6R alpha; nachgewiesenwerden konnte, liegt es nahe zu vermuten, dass die Rolle von AUP1 darin liegt, dieFähigkeit einer Zelle zu dämpfen, auf Stimuli von außerhalb der Zelle zu antworten,indem die Expression oder Funktionsfähigkeit dieser Rezeptoren auf derZelloberfläche negativ reguliert wird.