Blaulichtabhängige Genregulation in Rhodobacter sphaeroides : Untersuchungen zur physiologischen Funktion der Blaulichtphotorezeptoren AppA, CryB und LOV

Abstract

Licht stellt einen bedeutenden Umweltfaktor der Photosynthesegenregulation von phototropen Organismen dar. Da es neben seiner Funktion als Energieträger auch schädlichen Einfluss haben kann, müssen phototrophe Organismen Mechanismen entwickeln, um vorhandene Lichtreize in eine Genantwort umzusetzen. Blaulichtrezeptoren stellen dabei die häufigsten Proteine zur Lichtwahrnehmung in Prokaryoten dar und erlauben es ihnen, ihre Genantwort an die Bedingungen der Außenwelt anzupassen. In R. sphaeroides existieren mit dem AppA / PpsR und dem PrrB / PrrA - System bereits zwei Systeme mit einer gut charakterisierten Wirkung auf die Expression der Photosynthesegene. Kürzlich wurden mit dem Cryptochrom CryB und dem LOV - Domänen - Protein LOV zwei weitere Blaulichtrezeptoren in R. sphaeroides beschrieben. Während für das CryB - Protein eine Verbindung zur Regulation des Photosyntheseapparates hergestellt werden konnte, blieb die physiologische Rolle des LOV - Proteins noch unbekannt. Ziel dieser Arbeit war es das Verständnis der in vivo - Funktion dieser Proteine in R. sphaeroides zu verbessern. Durch die Analyse der Blaulichtsensitivität der BLUF - Domäne des AppA - Proteins konnte gezeigt werden, dass bereits minimale Blaulichtintensitäten ausreichen, um die Expression der Photosynthesegene bei gleichzeitigem Vorhandensein von Licht und Sauerstoff zu verhindern. Der lichtabhängige Anstieg der Photosynthesegenexpression bei geringem Sauerstoffpartialdruck durch das PrrB / PrrA - System konnte nur durch deutlich höhere Lichtintensitäten erreicht werden. Eine durchgeführte random Mutagenese der BLUF - Domäne führte nicht zu neuen Erkenntnissen zur Interaktion der BLUF - Domäne von AppA mit dem C - Terminus. Dafür konnte durch zielgerichtete Mutagenese von am Photozyklus beteiligen Aminosäuren gezeigt werden, dass Tryptophan 104 trotz seiner umstrittenen Rolle im Photozyklus in in vitro - Experimenten, in vivo die Blaulichtsensitivität der BLUF - Domäne beeinflussen kann. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass ein Basenaustausch des konservierten Tyrosin 21 immer zum Verlust der in vivo - Aktivität der BLUF - Domäne führt. Eine Doppelmutante führte überraschenderweise zur Wiederherstellung der in vivo - Aktivität der BLUF - Domäne, während in vitro das Protein keinen Photozyklus mehr besaß. Zur genaueren Eingrenzung des regulatorischen Einflusses des CryB - Proteins wurde dessen Interaktion mit bereits bekannten Regulatorproteinen untersucht. Dabei konnte im Yeast - Two - Hybrid - System sowie in den anschließend durchgeführten pulldown - assays eine Interaktion von CryB mit dem redox - sensitiven C - Terminus von AppA nachgewiesen werden. Die Interaktion von AppA mit PpsR wurde jedoch in Gel - Retardations - assays nicht durch die Anwesenheit von CryB beeinflusst. Für das LOV - und das CryB - Protein konnte im Yeast - Two - Hybrid - System zudem eine Interaktion mit Kapselpolysaccharidtransportern nachgewiesen werden. Es konnte jedoch keine Kapselbildung in den verwendeten R. sphaeroides - Stämmen gezeigt werden. Um die bisher völlig unbekannte physiologische Rolle des LOV - Proteins zu untersuchen, wurde ein microarray - Transkriptomchip von Rhodobacter sphaeroides 2.4.1 erstellt. Mit diesem wurde nach im Wildtyp 2.4.1 und der deltalov - Mutante differenziell exprimierten Genen, nach mikroaerobem Wachstum, Blaulichtbestrahlung und photooxidativem Stress, gesucht. In den Transkriptomanalysen konnten dabei eine große Zahl von Genen des Kohlenhydrat - und Aminosäurestoffwechsels und - transports, sowie der generellen Stressantwort identifiziert werden, welche durch den Einfluss des LOV - Proteins reprimiert werden. Gleichzeitig führte das Fehlen des LOV - Proteins zur Verringerung der Expression von Genen der Translation. Aus diesen Beobachtungen kann eine mögliche Beteiligung von LOV an der Regulation der stringent response gemutmaßt werden, deren Bestätigung jedoch noch weitere Untersuchungen erfordert. Light is one of the major factors in photosynthesis regulation of phototrophic organisms. Because it can act as an energy source for photosynthesis but also as an harmful generator of oxidative stress, phototrophic organisms have to evolve ways to transduce light signals into a transcriptional response. Blue light photoreceptors form the most abundant of photoreceptors in prokaryotes and allow them to adapt their genetic layout to environmental changes. The AppA / PpsR and PrrB / PrrA system in the facultative phototrophic R. sphaeroides are two well understood light dependent regulatory systems of the photosynthesis gene expression. Recently two additional blue light photoreceptors, a cryptochrome CryB and a LOV - domain protein called LOV were identified in R. sphaeroides. While a role in the regulation of photosynthesis gene expression for the CryB protein was shown, the physiological role of the LOV protein remains unclear. The goal of this work was to broaden the knowledge of the in vivo function of these photoreceptors in R. sphaeroides. By analyzing the blue light sensitivity of the BLUF domain of AppA I could show that minimal light intensities are sufficient to repress photosynthesis gene expression when light and oxygen are present simultaneously. The light dependent increase of photosynthesis gene expression mediated by PrrB / PrrA at low oxygen tension was only mediated by higher light intensities. While a random mutagenesis of the BLUF domain lead to no new insights in the interaction of the AppA and PpsR protein, site directed mutagenesis of amino acids involved in the photocycle, allowed a comparison of published in vitro data with in vivo experiments. An amino acid exchange in tryptophan 104 greatly decreased the in vivo light sensitivity of the protein, while changing tyrosine 21 lead to a loss of blue light dependent repression in the cell. Surprisingly a exchange of both amino acids lead to a recovered in vivo activity of the protein. To further characterize the function of the CryB protein in vivo, interaction against already known regulatory proteins was investigated. In a Yeast Two Hybrid screening and following pulldown analysis an interaction of the CryB protein with the redox sensitive C - terminus of the AppA protein was shown. The interaction between AppA and PpsR was not influenced by CryB in gel retardation assays. Furthermore the Yeast Two Hybrid screening hinted a connection between the LOV and CryB protein to capsule polysaccharide transporters. In different staining experiments no capsule synthesis was shown in the used R. sphaeroides strains. Because no physiological role of the LOV protein was known, a microarray transcriptome chip of Rhodobacter sphaeroides 2.4.1 was designed. This microarray chip was used to search for differentially expressed genes between the wild type 2.4.1 and the LOV mutant after microaerobic growth, blue light illumination and photooxidative stress. The transcriptome analysis revealed a higher expression of genes in the LOV mutant that are involved in carbon hydrate - and amino acid - metabolism, as well as the general stress response. The lower expressed genes in the mutant mainly belonged to genes involved in the ribosomal translation of the cell. This observation hints a possible role of the LOV protein in the regulation of the stringent response in Rhodobacter sphaeroides that needs to be further elucidated.