Interaktionspartner der Hepatitis C Virus-RNA und Zellzykluskontrolle

Abstract

In dieser Arbeit wird gezeigt, dass ein zelluläres Protein (p210) an die 5 - und 3 -UTR der HCV-RNA bindet, wenn diese Bereiche gemeinsam vorliegen. Des Weiteren wird gezeigt, dass die Effizienz der Translation der HCV-RNA in der G2/M-Phase des Zellzyklus stark abnimmt, und die HCV-Translation durch die leberspezifische microRNA-122 (miR-122) in der G0-, G1- und G2/M-Phase stimuliert wird. Dieser Befund korreliert sowohl mit der zellzyklus-abhängigen Expression der miR-122 als auch mit der Ago2-Menge in Hepatozyten.Das hier untersuchte Hepatitis C Virus (HCV) gehört zur Familie Flaviviridae und ist Auslöser der NonA-NonB-Hepatitis. HCV ist ein einzelsträngiges RNA-Virus mit einem Genom in positiver Orientierung, was nach der Infektion von Hepatozyten eine direkte Translation des Genoms ermöglicht. Das im einzigen offenen Leserahmen (ORF) kodierte Polyprotein wird post-translational in die reifen Genprodukte gespalten. Der ORF ist von zwei untranslatierten Regionen (UTRs) flankiert. Am 5 -Ende bilden die Stem-loops II - IV eine RNA-Sekundärstruktur, die die Funktion einer IRES (interne Ribosomeneintrittsstelle) hat. Diese ermöglicht durch eine direkte Bindung der Ribosomen eine cap-unabhängige Translationsinitiation. Darüber hinaus wird die Translation der HCV-RNA durch die leberspezifische miR-122 stimuliert. Daneben macht sich HCV, wie andere Viren auch, einige andere zelluläre Faktoren für seine Translation und Replikation zu Nutze. In dieser Arbeit wurden zwei Aspekte der Translation von HCV näher untersucht. Zum einen sollte ein vorher entdecktes, aber noch unbekanntes Protein mit der Größe 210 kDa (p210), welches an die HCV-RNA bindet und eventuell bei der Translation eine Rolle spielt, identifiziert und analysiert werden. Zum anderen wurde der Einfluss des Zellzyklus auf die Translation der HCV-RNA und dessen Stimulation durch die miR-122 überprüft.Die Charakterisierung des Proteins p210 wurde mit Hilfe von UV-Crosslinks verschiedener HCV-RNA-Konstrukte mit Zellextrakten durchgeführt. Dabei stellte sich heraus, dass dieses Protein in Huh7-, HeLa- und in Kaninchen-Retikulozytenlysat vorhanden ist, was auf eine nicht leber-spezifische Funktion hinweist. p210 interagiert mit der 5 - als auch mit der 3 -UTR von HCV und benötigt beide Regionen für seine Bindung. Allerdings konnte eine spezifische Bindung von p210 an die HCV-RNA nicht nachgewiesen werden.Im Laufe des Zellzyklus nimmt die cap-abhängige Translation von der G0- zur G2/M-Phase hin ab. Auch die HCV-IRES-Aktivität wird in ähnlicher Weise reduziert. Die Stimulation der HCV-Translation durch die miR-122 konnte in der G0-, G1- und G2/M-Phase sehr gut, in der S-Phase dagegen kaum nachgewiesen werden. Interessanterweise korreliert im Laufe des Zellzyklus das Ausmaß der Stimulation der HCV-Translation durch die miR-122 mit der Menge an miR-122 und mit der Menge an Ago2-Protein in der Zelle. Damit zeigen die Ergebnisse, dass HCV seine Translation optimal an die in Hepatozyten herrschenden Bedingungen angepasst hat. In this study a protein (p210) was shown to bind to the 5 - and 3 -end of HCV-RNA if these untranslated regions are both available at the same time. Moreover, the efficiency of translation of the HCV-RNA is strongly reduced in the G2/M phase of the cell cycle. The stimulation of HCV translation by the liver-specific microRNA-122 (miR-122) is highest in G0-, G1- und G2/M-phase. This result correlates with the cell cycle dependent expression of the miR-122 and of Ago2 protein in hepatocytes.The Hepatitis C virus belongs to the family of Flaviviridae and is the main causative agent of NonA-NonB hepatitis. The virus genome consists of a single stranded RNA with positive orientation that allows direct cap-independent translation after infection of hepatocytes. The HCV genome consists of one open reading frame coding one polyprotein that is processed after translation to the mature proteins. The open reading frame is flanked by two untranslated regions. At the 5 -end a highly structured region including stem-loop II - IV forms an IRES (internal ribosome entry site). This structure allows direct binding of ribosomes without the need for any eukaryotic initiation factors. Moreover, HCV translation is stimulated by the liver-specific miR 122. As other viruses, HCV also uses some cellular proteins for its translation and replication. Since many eukaryotic proteins bind to the HCV-RNA, there may be more unidentified proteins that interact with the HCV-RNA and regulate its translation. In this study two aspects of HCV translation were analyzed. On the one hand, the interaction of an unknown 210 kDa protein with the HCV RNA was characterized. On the other hand, the influence of the cell cycle on HCV translation and on translation stimulation by miR-122 was investigated.Characterization of the protein p210 was done by UV-crosslinks using various HCV-RNA constructs and various cell lysates. p210 was identified in Huh7-, HeLa- and rabbit reticulocyte lysate. Thus, p210 may have a general function but is not liver-specific. Binding of p210 requires both untranslated regions of the HCV-RNA. However, specific binding of p210 to the HCV-RNA could not be observed.The HCV-IRES translation efficiency as well as the cap-dependent translation efficiency is decreased in the G2/M-phase of the cell cycle. Stimulation of HCV-RNA translation by miR 122 is highest in the G0-, G1- and G2/M-phases, whereas little stimulation was detected in the S-phase. Interestingly, the extent of this stimulation roughly correlates with the levels of microRNA-122 during different cell cycle phases. Moreover, also the expression of Ago2, a miRNP (microRNA protein complex) component correlates with the extent of HCV translation stimulation by miR-122 during individual cell cycle stages. Thus, the regulation of HCV translation appears optimally adapted to the conditions in hepatocytes in normal liver tissue.