Detection and characterization of secreted proteins from Piriformospora indica during Arabidopsis roots colonization

Abstract

The basidiomycete P. indica is a root endophyte, which has a beneficial impact on host plants. P. indica promotes growth in colonized host plants and mediates biotic stress resistance as well as abiotic stress tolerance such as drought or salt stress (Waller et al., 2005; Baltruschat et al., 2008). The fungus has a broad host spectrum and non-host plants have not been identified so far. During the establishment of a compatible interaction, the fungus is able to actively suppress root immune responses of the host plant including the root oxidative burst, induction of defense genes and callose deposition. Especially JA signaling seems to be influenced by P. indica during the active suppression of host basal defense. The colonization pattern of P. indica can be mainly divided in an initial biotrophic and a later cell death-associated phase (Schäfer et al., 2009; Jacobs et al., 2011). To reach compatibility with the host plant, P. indica is assumed to secrete a battery of effector proteins, especially during the biotrophic interaction phase. Effector proteins are secreted by pathogenic as well as beneficial microbes during plant colonization in order to suppress the plant innate immune system and to manipulate the host metabolism. Due to the broad host range which includes model plants like Arabidopsis, barley and tobacco, P. indica is an ideal model organism for the investigation of fungal derived effector proteins and their impact on plant innate immunity. The aim of this study was the identification and subsequent characterization of P. indica effector proteins. Therefore, the yeast signal sequence trap (YSST) was successfully applied. Eleven different secreted P. indica proteins could be isolated. Additionally, the P. indica effector candidate PIIN_00029 (PiALH43), which was previously identified (Khatabi, 2009), was included in this study. The in silico analyses revealed similarities of eight candidates to known or putative effector proteins identified in other biological systems. Furthermore, six of the candidates are probably associated with the cell membrane. The isolated effector candidates could be functioning in the adhesion of the fungus to the host surface or even in masking P. indica-derived MAMPs. In qPCR-based analyses, nine candidates showed the highest expression during biotrophic colonization (2 dai) of Arabidopsis roots in comparison to axenically grown P. indica or P. indica colonizing dead roots. Localization studies with GFP fusion proteins revealed a cytoplasmic expression pattern of the candidate PIIN_08513. This candidate was furthermore demonstrated to suppress MAMP-triggered oxidative burst upon transient overexpression in N. benthamiana leaves. The present work is a base for future studies on P. indica effectors and their impact on plant innate immunity and host metabolism. Functional studies on the RING E3 ligase PIIN_00029 (PiALH43) revealed that this enzyme had neither a proapoptotic nor antiapoptotic activity in yeast viability assays. Further, plant basal defense was not influenced in N. benthamiana leaves transiently expressing PIIN_00029. Arabidopsis plants stably expressing PIIN_00029 showed partly enhanced colonization by P. indica. PIIN_00029 might manipulate plant metabolism by the targeted labeling of proteins for degradation in order to enhance root colonization. The results of this work can be used as base for the characterization of further P. indica secreted proteins. Der Basidiomyzet P. indica ist ein Wurzelendophyt, der verschiedene nützliche Auswirkungen auf seine Wirtspflanzen hat. P. indica hat wachstumsfördernde Effekte auf die Wirtspflanze, zusätzlich werden besiedelte Pflanzen resistenter gegen Pathogenbefall und abiotischen Stress wie Trocken- oder Salzstress (Waller et al., 2005; Baltruschat et al., 2008). Der Pilz verfügt über ein breites Wirtsspektrum. Bisher wurden keine Pflanzenarten gefunden, die nicht von P. indica besiedelt werden können. Während der Ausbildung einer kompatiblen Interaktion mit der Wirtspflanze ist der Pilz in der Lage, die Abwehrreaktionen der Pflanze aktiv zu unterdrücken. Der Pilz unterdrückt in Wurzeln die Bildung reaktiver Sauerstoffspezies, die Aktivierung von Abwehrgenen oder die Auflagerung von Callose. Insbesondere der Jasmonsäure-Signalweg wird vermutlich zur Unterdrückung der basalen Abwehr durch P. indica beeinflusst. Die Interaktion von Pflanze und Pilz kann im Wesentlichen in eine anfängliche biotrophe und eine spätere Zelltod-assoziierte Phase unterteilt werden (Schäfer et al., 2009; Jacobs et al., 2011). Um die Kompatibilität mit der Wirtspflanze zu erreichen wird vermutet, dass P. indica zahlreiche Effektorproteine, vor allem in der biotrophen Interaktionsphase, sekretiert. Effektorproteine werden von Pathogenen wie auch nützlichen Mikroorganismen sekretiert, um die Abwehr zu unterdrücken und den Metabolismus der Wirtspflanze zu manipulieren. Aufgrund seines breiten Wirtsspektrums ist P. indica ein idealer Modellorganismus zur Studie pilzlicher Effektorproteine, da auch Modellpflanzen wie Arabidopsis, Gerste und Tabak von dem Pilz besiedelt werden können.Das Ziel dieser Studie war die Identifizierung und anschließende Charakterisierung von P. indica-Effektorproteinen. Hierfür wurde der yeast signal sequence trap (YSST) erfolgreich durchgeführt. Es konnten insgesamt elf sekretierte, putative Effektorproteine isoliert werden. Zusätzlich wurde der Effektor-Kandidat PIIN_00029 (PiALH43), welcher kürzlich identifiziert wurde (Khatabi, 2009), in die Studien einbezogen. Die in silico Analyse ergab Ähnlichkeiten von acht Kandidaten zu bekannten oder putativen Effektorproteinen aus anderen biologischen Systemen. Sechs der Kandidaten könnten außerdem mit der Zellmembran assoziiert sein. Somit könnten die isolierten Kandidaten eine Funktion bei der Anheftung des Pilzes an die Wurzeloberfläche oder auch in der Maskierung von MAMPs vor dem pflanzlichen Immunsystem haben. In qPCR-basierten Analysen konnte für neun Kandidaten das höchste Expressionsniveau während der biotrophen Besiedlung (2 dai) lebender Pflanzenwurzeln nachgewiesen werden. Im Vergleich dazu waren die Expressionsniveaus während der Besiedlung toten Wurzelmaterials oder von in Flüssigkultur wachsenden Hyphen weitaus geringer. Lokalisationsstudien mit GFP-Fusionsproteinen ergaben ein zytoplasmatisches Expressionsmuster des Kandidaten PIIN_08513. Dieser Kandidat scheint außerdem die basale Pflanzenabwehr supprimieren zu können, wie in transient mit PIIN_08513 transformierten N. benthamiana Blättern gezeigt werden konnte. Zum Nachweis wurde hier der oxidative burst nach flg22 Behandlung gemessen. Funktionale Studien mit der putativen RING E3 Ligase PIIN_00029 (PiALH43) ergab keine proapoptotische oder antiapoptotische Wirkung des Enzyms in Hefe-basierten Zelltodstudien. Eine Beeinflussung der basalen Pflanzenabwehr nach transienter Überexpression in N. benthamiana konnte nicht festgestellt werden. Die stabile Überexpression von PIIN_00029 in Arabidopsis ergab eine transient höhere P. indica Besiedlung von Arabidopsiswurzeln, welche PIIN_00029 überexprimieren. PIIN_00029 könnte durch die gezielte Degradierung von Proteinen den Pflanzenmetabolismus und somit die Besiedlung beeinflussen.Die Ergebnisse dieser Arbeit können als Basis für die Charakterisierung weiterer sekretierter P. indica Proteine verwendet werden.