Etablierung reiner Endothelzellkultur aus sich differenzierenden embryonalen Stammzellen

Abstract

Das Endothel ist für die Aufrechterhaltung der Gefäßfunktion von essentieller Bedeutung. Störungen wesentlicher Endothelfunktionen werden unter dem Oberbegriff der endothelialen Dysfunktion zusammengefasst. Die endotheliale Dysfunktion wird als ein Schlüsselereignis in der Pathologie der kardiovaskulären Erkrankungen wie Arteriosklerose, Koronare Herzkrankheit, Bluthochdruck, Diabetes, kongestive Herzinsuffizienz und pulmonale Hypertonie angesehen. Die enorme sozioökonomische Bedeutung dieser Erkrankungen ist unumstritten. In der Vergangenheit wurden deshalb viele medikamentöse sowie chirurgische Behandlungsmethoden entwickelt, die jedoch besonders bei schweren Erkrankungen keine langfristig zufriedenstellenden Optionen bieten. Neuere Studien haben bewiesen, dass progressive ischämische Funktionsstörungen und Schäden von Organen durch neue therapeutische Strategien, wie die zell-basierte Therapie, verhindert und wieder hergestellt werden können. Diese Ansätze sehen einen Einsatz autologer, aus dem peripheren Blut oder Knochenmark stammender Vorläuferzellen vor. Trotz der in diesem Feld erreichten Fortschritte bleibt eins der noch nicht gelösten Probleme, die schwierige und akkurate Definierung der Vorläuferzellen, ihre Herkunft und Funktion während der Wiederherstellung der Gefäße. Des Weiteren enthält das periphere Blut nur einen geringen Anteil an Vorläuferzellen und die Gewinnung von Knochenmark beruht auf aufwendigen, invasiven Methoden. Embryonale Stammzellen, die sich zu jedem beliebigen Zelltyp entwickeln können, könnten hier als eine Quelle für therapierelevante Zellen dienen. Aus ethischen Gründen und auf Grund der Immunogenität ist die klinische Anwendung der ES-Zellen jedoch schwierig. Durch den Einsatz induzierter pluripotenter Stammzellen können diese Probleme umgangen werden. In der vorliegenden Arbeit wurde ein Versuch unternommen, eine Methode zu entwickeln, routinemäßig große Mengen von Endothelzellen von murinen embryonalen Stammzellen abzuleiten. Zu Beginn sollten die Zellen unter Verwendung von magnetic beads im Zusammenhang mit dem endothelzellspezifischen Oberflächenantigen Flk-1 mechanisch aufgereinigt werden. Es ist eine einfach anzuwendende Methode, die jedoch trotz dem, bei der Differenzierung erreichten Anteil an Flk-1 positiven Zellen von 40% und auf Grund der schlechten Expandierbarkeit isolierter Zellen, nur einen geringen Durchsatz bot. Die Etablierung rekombinanter ES-Zelllinien, die unter der Kontrolle endothelspezifischer Promotoren Flk-1 bzw. VE-Cadherin ein Reporter- und ein Resistenzgen exprimieren und eine Antibiotikaselektion der Zellen ermöglichen, sollte an dieser Stelle die mit der mechanischen Isolierung verbundenen Probleme beseitigen. Der Gentransfer in ES-Zellen wurde zunächst über die Elektroporation der Vektoren pFlk und pVE-Cad mit anschließender Antibiotikaselektion stabil-transfizierter Klone durchgeführt. Durch die sehr niedrige Effizienz der Transfektion wurde jedoch zur Anwendung einer weiteren Gentransfermethode, der lentiviralen Transduktion, zurückgegriffen. Diese Methode lieferte auf Anhieb positive Ergebnisse bei einer sehr hohen Effizienz und führte zur Etablierung mehrerer unter der Kontrolle des Flk-1 Promoters GFP- und Zeocin-exprimierender ES-Zellklone. Die generierte ES-Zelllinie soll nun eine antibiotikagestützte Isolierung Flk-1 positiver Zellen ermöglichen. Auf Grund der zellspezifischen GFP-Expression eröffnen sich weitere Anwendungsmöglichkeiten dieser Zelllinie, wie z.B. die Optimierung der Differenzierung in Richtung Endothel. Endothelium is of essential importance for the maintenance of vessel function. Endothelial dysfunction is considered as a key event in the pathology of cardiovascular diseases such as atherosclerosis, coronary artery disease, hypertension, diabetes, congestive heart failure, and pulmonary hypertension. The huge socioeconomic burden of these diseases is indisputable. Up to now, many pharmacological as well as surgical therapeutic approaches have been developed with few long-term satisfactory outcomes, particularly in severe cases. Newer studies have proven that progressive ischemic dysfunction and organ damage can be prevented and restored by new therapeutic strategies like cell-based therapy. These attempts encompass application of autologous progenitor cells derived from peripheral blood or bone marrow. Notwithstanding the proceedings in this field, the accurate definition and origin of progenitor cells and their function during vessel recovery still remain as unsolved issues. Besides, peripheral blood contains only a low fraction of endothelial progenitor cells and extraction of these cells from bone marrow is based on invasive methods. Embryonic stem cells can develop into any functional cell type, and may serve as a source for cell therapy. Nevertheless, because of ethical concerns about and immunogenicity of embryonic stem cells, their clinical use is still controversial. These problems can be avoided by application of induced pluripotent stem cells. The present work focuses on development of a method to routinely derive large numbers of endothelial cells from differentiating murine embryonic stem cells. At the beginning, the cells were isolated using magnetic beads in connection with the endothelial-specific surface antigen fetal liver kinase-1(Flk-1). Despite the development of as much as 40% Flk-1 positive cells, the isolated cells were hardly expandable, rendering this system as low-throughput and inefficacious. With this idea, transgenic cell lines expressing a reporter and a resistance gene under the control of endothelial-specific promoters such as Flk-1 and VE-Cadherin were established, allowing for antibiotic selection of desired cells as a solution to the problems linked with mechanical isolation. Gene transfer in embryonic stem cells was carried out by electroporation of pFlk and pVE-Cad vectors, followed by antibiotic selection of stably transfected clones. Due to the high efficiency of lentiviral transduction, this strategy was later adopted as the alternative approach for gene transfer. Taking advantage of this approach yielded robustly positive results with a very high efficiency, leading to the establishment of several embryonic stem cell clones, expressing GFP and zeocin under the control of the Flk-1 promoter. The generated embryonic stem cell line will later allow for the antibiotic-supported isolation of Flk-1 positive cells. In addition, the cell-specific GFP expression in these cell lines, will also be useful for other applications such as enhancement of differentiation towards endothelial cells, as well as developmental studies.