Phänotypische Charakterisierung klinisch relevanter Hepatitis-B-Virus-Mutanten

Abstract

Weltweit sind etwa 350 Millionen Menschen chronisch mit dem Hepatitis B Virus (HBV) infiziert. Neben Interferon alpha stehen zur Behandlung nur Reverse Transkriptase (RT) Inhibitoren als zugelassene Arzneimittel zur Verfügung. Aufgrund der hohen Variabilität des Virus, sowie der notwendigen lebenslangen Behandlung mit RT-Inhibitoren, stellt die Entwicklung resistenter HBV-Varianten ein großes Problem dar. Bisher gab es keine effizienten und einheitlichen In-vitro-Testsysteme, um den Phänotyp von resistenten Viren bestimmen zu können. Das Verständnis der Zusammenhänge zwischen Genotyp und Phänotyp des HBV ist wichtig, um die Behandlung der Patienten auf Grundlage von Sequenzinformationen optimieren zu können.In dieser Arbeit wurde ein In-vitro-Resistenztestsystem entwickelt. Auf Grundlage eines Vektors, der ein replikationsfähiges HBV-Überlängenkonstrukt enthält, sowie einer speziellen Real-Time-PCR, konnte ein Verfahren etabliert werden, das die schnelle und genaue Charakterisierung der Resistenzprofile von Patientenisolaten ermöglicht.Mit diesem Verfahren wurden 44 Patientenisolate phänotypisch charakterisiert. Anhand der Daten konnte nachgewiesen werden, dass die bisherigen Erkenntnisse zur Resistenzentwicklung nicht ausreichen, um die Diversität der Phänotypen vollständig zu erklären. Wichtigster Befund ist, dass die Resistenzen einiger der getesteten Viren nicht allein auf die bisher ausschließlich beachteten Mutationen in den katalytischen Subdomänen der RT-Domäne zurückzuführen sind, sondern wahrscheinlich auch Mutationen außerhalb dieses Bereichs einen entscheidenden Einfluss auf die Resistenzentwicklung ausüben können. Das entwickelte System konnte in leicht abgewandelter Form ebenfalls dazu verwendet werden, die früher postulierte Adefovir-Resistenzmutation rtI233V genauer zu charakterisieren, sowie neu entwickelte Inhibitoren auf ihre In-vitro-Wirksamkeit, sowie Kreuzresistenz zu testen.Neben dem Resistenztest wurde eine Methode zur schnellen und effizienten Herstellung stabiler HBV-produzierender Linien auf Grundlage eines episomalen Vektorsystems entwickelt und eine den bisher publizierten Methoden überlegene Klonierung zur Generierung von 1.1fachen Überlängenkonstrukten aus Virionen von Patientenseren ohne Vektorkassette. About 350 million people are chronically infected with the Hepatitis B Virus (HBV) wordwide. Besides interferon alpha are currently only reverse transcriptase (RT) inhibitors available for therapy. Because of the high variability of the virus and the inevitable life-long treatment, the development of resistant variants is a major issue. So far no efficient and standardised in vitro test systems were available for phenotypic resistance testing. The understanding of the correlation between phenotype and genotype of HBV is important, to optimize the treatment on the basis of sequence information.In this work an in vitro resistance test system has been developed. On the basis of a vector, which contains a replication competent HBV-overlength construct, and a special discriminative real time PCR, a system has been established, which allows for fast and accurate characterisation of resistance profiles from patients sera. With this method 44 HBV DNA isolates from patients were characterised. The results showed, that the previous scientific findings, concerning the development of resistance, are not sufficient to account for the diversity of the resistant phenotypes completely. The most important finding was that the resistances, of the tested viruses, did not only depend on the previously observed mutations in the catalytic subdomains of the RT-domain, but probably also on mutations outside of this region. The developed system was also used in slightly modified form to further characterise the previously postulated adefovir resistance mutation rtI233V and to test the in vitro effects and the cross resistance pattern of newly developed inhibitors.In addition to the resistance test a fast and efficient method for production of stably HBV-producing cell lines was established on the basis of an episomal vector system. Furthermore, a cloning method for the generation of 1.1 overlength products directly from patient-derived virions, without the need of a vector cassette was developed, that is superior to the methods described in literature.